Тема 12 «Лабораторная диагностика лептоспироза»

Цель – формирование практических умений проводить лабораторную диагностику лептоспироза, формирование знаний о сущности и технике проведения бактериологических и серологических методов исследований, умений выделять биологические особенности возбудителя, работая с лабораторным оборудованием, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации, сопоставление биологических особенностей лептоспир разных серологических групп.

План

1. Патологический материал для лабораторного исследования.

2. Бактериологические методы диагностики сибирской язвы.

3. Серологические методы диагностики сибирской язвы.

Материальное обеспечение: предметные и покровные стекла, пипетки, резиновая груша, спиртовка, микроскоп с темнопольным конденсором и осветителем ОН-17, пластины из плексигласа с луночками, физиологический раствор, четыре пробирки, ножницы, антиген для диагностики лептоспироза, сыворотка, высушенная на фильтровальной бумаге, культура лептоспир. Таблицы (Морфология лептоспир. Формы колоний, Схема бактериального исследования. Биопрепараты).

Теоретический материал

Материалом для исследования на лептоспироз служат: кровь (лучше брать на 3-5-й день болезни при повышенной температуре тела), моча, кусочки паренхиматозных органов, почка, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод. Патологический материал отбирается не позже 2 часов после гибели животного. Моча собирается при естественном мочеиспускании и в летнее время исследуется в течение 3 часов.

Микроскопия. Исследуют мочу, цитратную кровь, тканевую суспензию. Микроскопию проводят в раздавленной капле с конденсором «темного поля». Типичные лептоспиры подвижны и имеют форму прямой или S-образно изогнутой серебристо-белой нити с загнутыми в виде крючков концами. Лептоспиры также можно обнаружить в срезах из органов после импрегнации серебром по методу Левадити.

Выделение культур. Материал засевают по 1-3 капли одновременно в 3-5 пробирок со специальной питательной средой и инкубируют при температуре 28-30⁰С в течение 3 мес. Лептоспиры начинают размножаться через 7-20 дней, иногда 1-2 и очень редко – 3 мес. Наличие роста контролируют темнопольной микроскопией раздавленных капель, которые готовят через каждые 5 дней из всех пробирок. При обнаружении размножения лептоспир делают пересев в 3-5 пробирок со свежей средой. Получить культуры лептоспир удается не всегда.

Биологическая проба. Метод более эффективный, чем бактериологический; проводится с целью выделения и очистки культур лептоспир, определения вирулентности и дифференциации от сапрофитов.

Серологическое исследование. Для серологической диагностики лептоспироза используют РМА (реакция микроагглютинации) и реакцию агглютинации (РА). Пробы крови берут на 5-7-й день болезни и при исследовании отдельных животных повторно через 7-10 дней. Необходимо помнить, что антитела в крови у выздоровевших животных могут сохраняться до двух и более лет.

Реакция микроагглютинации (РМА) является высокоспецифичной, доступной, не требует дорогостоящего оборудования и больших затрат времени.

Впервые серологическую диагностику лептоспироза у людей предложили Мартен и Пети в 1919г. Метод исследования ими был назван реакция агглютинации, в последующие годы называли – реакция микроагглютинации и лизиса (РМА и Л), в настоящее время принято название реакция микроагглютинации (РМА).

РМА нашла широкое применение и в ветеринарной практике. В разные годы учёными были предложены модификации серологического исследования (РМА) на лептоспироз: для собак – Уленгут и Циммерман (1936 г.); для крупного рогатого скота – Терских, Земсков (1939г.), Романенко, Любашенко (1940г.), Ляпустин (1945г.); для овец и коз – Терских, Газарян, Саркисян (1942г.), Ляпустин, Варфоломеева (1945г.); для свиней – Терских(1940г.) и др.

Сущность реакции и цель применения. В основе реакции микроагглютинации (РМА) лежит специфическое взаимодействие между антигенами (живые культуры лептоспир) и антителами. РМА применяют с целью обнаружения в сыворотке крови животных антител, специфичных возбудителю лептоспироза, и определения их количества (титра).

Материалы исследований. Для исследования используют свежую, замороженную, высушенную на фильтровальной бумаге, консервированную фенолом или борной кислотой сыворот­ку крови. Кровь для серологического исследования берут в количестве 5-10 см³ не ра­нее чем через 5-7 суток после проявления клинических признаков болезни или че­рез 90 суток – для крупного рогатого скота, 60 суток – для свиней и животных других видов после введения вакцины.

Компоненты реакции и подготовка материала к исследованию. В РМА участвуют сыворотка крови животных и культуры лептоспир. Нативные сыворотки проверяют (гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют). Замороженные сыворотки оттаивают при комнатной температуре. Повторное замораживание сывороток не допускается. Сыворотки разбавляют физиологическим раствором невакцинированных животных в соотношении 1:25; вакцинированных животных – 1:50. После добавления антигена разведения удваиваются и составляют соответст­венно 1:50 и 1:100. При необходимости сыворотку разбавляют в соотношениях 1:100; 1:200; 1:400 и т.д.

Консервация сыворотки крови методом высушивания. На квадраты белой филь­тровальной бумаги (5х5см) наносят по 3-5 капель (0,05 см³ каждая капля) сыворотки. Высушивание проводят при комнатной температуре. Высушенные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. При исследовании сыворотки, высушенной на фильтровальной бумаге, выреза­ют одну или две капли (0,05 или 0,1 см³) сыворотки, измельчают ножницами и заливают в пробирки с физиологическим раствором в объёме 2,45 или 4,9 см³, соответственно, экстрагируют в течение одного часа при температуре 37±1°С. Полученный экстракт используют как исходное разведение сыворотки 1:25 или 1:50.

Сыворотку крови животных при ввозе их в хозяйство и вывозе из него для племенных целей и целей воспроизводства разводят 1:25 и исследуют только в одном разведении (после добавления антигена разведение сыворотки будет соответ­ствовать 1:50).

При изучении этиологической структуры и обследовании импортируемого ско­та реакцию ставят со всеми приведенными в таблице антигенами, при обследова­нии животных в хозяйствах с известной этиологией и при перевозке внутри страны реакцию ставят с антигенами 4-7 серогрупп (Pomona, Tarassovi, Canicola, Hebdomadis, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorragiae).

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всероссийском государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов не реже одного раза в год.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5-15 суток без признаков агглютинации и лизиса. Через каждые три месяца лаборатории контролируют диагностические штаммы лептоспир в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми агглютинирующими сыворотками.

Порядок постановки реакции. Разведенную сыворотку разливают мерной пипеткой или аппаратом Флоринского, начиная с большего разведения, в лунки агглютинационных пластин или про­бирки по 0,1 см³ в каждую. Сыворотку из каждого разведения разливают в отдельный ряд, состоящий из 4-23 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 см³ в 1-3 лунки в зависимости от количества разведений сыворотки. После добавления антигенов пластины встря­хивают и выдерживают в термостате при 30-37°С в течение часа. Контрольной служит смесь 0,1 см³ культуры лептоспир с 0,1см³ фи­зиологического раствора. Лептоспиры в контрольном варианте должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

Учет и оценка реакции. Реакцию, учитывают микроскопией капель из каждой лунки в тёмном поле микроскопа при увеличении 20х10 или 40х7х1,5. Капли из лунок наносят на предметное стекло бактериологической петлёй из большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли наносят двумя способами:

- бактериологической петлёй диаметром 3 мм. Наносят на стекло сразу до 30 ка­пель и просматривают их под микроскопом;

- бактериологической петлёй диаметром 1мм. Наносят на предметное стекло в освещённый центр поля зрения одну каплю и просматривают её, передвигая столик на 2-3 мм, и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. Перед взятием каждого нового антигена петлю прокаливают и охлаждают.

Результаты реакции оценивают в крестах:

++++ (#) агглютинированы 100 % лептоспир;

+++   агглютинированы 75 % лептоспир;

++     агглютинированы 50 % лептоспир;

+       агглютинированы 25 % лептоспир;

-        агглютинация отсутствует.

Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3-5 до нескольких десятков и сотен лептоспир. Свободные кон­цы лептоспир сохраняют подвижность. В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоспир, проявляющийся в набухании и прекращении движения клеток, появлении зернис­тости и полного распада микробных клеток. Положительной считают РМА, с оценкой в два креста и более при отсутст­вии агглютинации в контроле. Наличие специфических антител в сыворотке крови животных в титре 1:50 и выше невакцинированных, и 1:100 и выше у вакцинированных свидетельствуют об инфицировании данной особи лептоспирами и, возможно, лептоспироносительстве. По результатам реакции микроагглютинации возбудителями лептоспироза считают лептоспиры той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на лептоспироз.

Этапы выполнения задания:

1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований. Обоснуйте выбор материала при жизни и после гибели животного.

2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики.

3 Определите порядок выполнения серологического исследования биоматериалов.

4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь.

Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства культуры лептоспир.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовьте препарат для темнопольной микроскопии из бульонной культуры.

2 Микроскопируйте препарат, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю.

Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробных культур.

Этапы выполнения задания:

1 Опишите рост лептоспир в жидких средах.

2 Опишите рост лептоспир в плотных средах.

3 Поясните особенности роста лептоспир в питательных средах, сделайте заключение.

Практическое задание 4: Проведите серологическое исследование сыворотки крови животных на лептоспироз РМА.

Этапы выполнения задания:

1 Подготовьте сыворотку крови, высушенную на фильтровальной бумаге к исследованию.

2 Внесите сыворотку из каждого разведения в необходимом количестве в лунки пластигласовых пластин и добавьте антиген.

3 Поставьте необходимые контроли.

4 Проведите учет и оценку реакции микроскопическим методом.

3 Зарисуйте результаты реакции в контрольной и опытной пробах, посните результаты преподавателю.

Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при лептоспирозе.

Этапы выполнения задания:

1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения.

2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату.

3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните правила взятия и подготовки материала для бактериологической диагностики лептоспироза. 2 Какой вид микроскопии применяют при исследовании мочи животных на лептоспироз? 3 В чем сущность серологической диагностики лептоспироза с помощью РМА? 4 Почему реакция называется микроагглютинации? 5 В чем заключаются отличительные особенности течения лептоспироза у свиней и других с.-х. животных? 6 Какими биологическими свойствами обладает возбудитель лептоспироза? 7 Назовите возбудитель лептоспироза. 8 Сколько серологических групп возбудителя лептоспироза известно? 9 Поясните порядок культивирования лептоспир в лаборатории. 10 Какие биопрепараты применяют при лептоспирозе?

⇐ Предыдущая9101112131415161718Следующая ⇒

Поделиться: