|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Работа 1.3. Выращивание суспензионной культуры клеток хеликобактерий, культивирование клеток хеликобактерий на кровяном агареСтр 1 из 11Следующая ⇒
Материалы и оборудование
Для работы 1.3 необходим реперный штамм хеликобактерии Helicobacter pylori, гомогенаты внутренних органов из инфицированных лабораторных животных.. При выращивании хеликобактерий следует соблюдать меры предосторожности, разработанные и повсеместно применяемые при работе с условно-патогенными мироорганизмами III класса опасности. Помимо медицинского халата и одноразовых перчаток нужно надеть защитную маску (респиратор), головной убор с убранными под него волосами и очки …. Работать нужно в микробиологическом боксе II класса микробиологической защиты. Студенты не работают с живыми культурами!, они начинают работы по выделению ДНК из обеззараженных сильным нагреванием в СВЧ-печи гомогенатов внутренниз органов из лаб. животных..//////////////////////..
Характеристики используемых в практикуме бактериальных штаммов и плазмид приведены в приложениях. Растворы - Среда кровяной агар (основа - 2YT).На 1 л: триптон – 16 г; дрожжевой экстракт – 8 г; NaCl – 5 г. Довести до 1 л дистиллированной водой, рН среды 7, 0. Добавить 5-10 мл свежей или замороженной цельной крови. Для получения твёрдой среды в неё добавляют перед автоклавированием агар до 1, 5%. Методика 1. Произвести высев аликвоты 200 мкл из гомогената внутренних органов лабораторных мышей или крыс в пробирку с 5 мл жидкой питательной среды 2 YT и растить культуру бактериальных клеток в течение ночи с аэрацией при 37 ° С а. Перенести 0, 5 мл культуры на пластиковую чашку Петри с кровяным агаром и растить в течение периода времени от 1 суток до 1 недели. Собрать выросший бактериальный газон шпателем в 1, 5 мл пробирку Эппендорф. О садить клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин. Выделить ДНК и спользовать для ПЦР-анализа. Примечания а О выращивании патогенных бактерий см. в руководствах по медицинской микробиологии. Некоторые сведения представлены в данном пособии только там, где это необходимо.
Работа 1.4. Выращивание штаммов кишечной палочки, содержащих векторные фагмиды и хелперные фаги Процедура выращивания культур бактериальных клеток с фагмидами и фагами является необходимым этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. Клетки необходимо поместить в питательную среду, инфицировать (“заразить”) фагами и создать оптимальные условия выращивания. Энтеробактерии хорошо растут на полных питательных средах при температуре 25 - 37 С.
Методы культивирования бактерий с фагами включают следующие этапы:
1) Инокуляция свежей порции питательной среды небольшим количеством растущей суспезионной культуры бактериальных клеток (или колонией с твердоой агаризованной среды); 2) Помещение колбы или пластиковой ёмкости с бактериальными клетками на термостатируемую качалку-шейкер с установленным режимом, оптимальным для деления клеток и роста культуры. 3) Культивирование культуры клеток в течение ночи (получается так называемая “ночная культура”, находящаяся в логарифмической фазе роста). 4) Определение концентрации клеток и использование для выделения плазмидной и фаговой ДНК, либо для использования в качестве инокулянта или других анализов, Материалы и оборудование
Для работы 1.4 необходим штамм энтеробактерии JS5 c фагмидой pHEN1 фагом-хелпером KO7. Характеристика штамма и фагмид и фага приведены в приложениях 1 и 2. Растворы - Среда 2YT.На 1 л: триптон – 16 г; дрожжевой экстракт – 8 г; NaCl – 5 г. Довести до 1 л дистиллированной водой, рН среды 7, 0. Для получения твёрдой среды в неё добавляют перед автоклавированием агар до 1, 5%. - 24: 1 по объёму. Методика 1. Произвести отдельной колониейпосев бактерий штамма E. coli XL1–Blue(или A. егьуафсшуты С58) в пробирку Falcon с 5 мл жидкой питательной среды 2YT и растить культуру бактериальных клеток в течение ночи с аэрацией при 37°С (или 30°С, соответственно) а. 2. Перенести микропипеткой 1, 5 мл культуры в микроцентрифужную пластиковую пробирку типа Eppendorf объёмом 1, 7 мл. Осадить клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин или на максимальной скорости микроцентрифуги Эппендорф при 12, 4 – 12, 6 об/мин. 3. Выделить ДНК из осадка любым из описанных ранее методов. 4. Выделить фагмиды из надосадочной жидкости по протоколу ….. Примечания а О выращивании бактерий см. в руководствах по микробиологии. Некоторые сведения представлены в данном пособии только там, где это необходимо
Тема 2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы:
1) лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом); 2) ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеини-зацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; Центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирова-ния растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия - SDS и хаотропный агент - гуанидинизотиоцианат.
Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых силикой SiO2 (силикагель). Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенол-хлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным. Количественная и качественная оценка образца полученной ДНК осуществляется при последующей стандартной процедуре электрофореза ДНК в агарозном геле (тема 3) путём визуального сравнения с образцами известной концентрации. Спектрофотометрическое определение даёт более точную характеристику препарату ДНК (тема 3)
Работа 1.1. Выделение ДНК из бактерий
Выделение общей или тотальной ДНК из клеток бактерий с использо-ванием додецилсульфата натрия, протеиназ и фенола ( Dhaese et al., 1979 ) является достаточно распространённым подходом к задаче. Метод простой и надёжный, существует в ряде модификаций, как и многие другие методы.
Наряду с хромосомной ДНК выделяется также плазмидная и фаговая ДНК при их наличии в клетке, а также РНК, от которой несложно избавиться.
Плазматическая мембрана бактериальной клетки в этом методе разрушается под действием детергента додецилсульфата натрия ( SDS , sodium dodecyl sulfate ) – одного из самых распространённых поверхностно-активных веществ, или ПАВ. Целостность пептидогликанового слоя, так называемого муреинового мешка, при этом тоже нарушается. Путём обработки бактериального лизата фенолом, который денатурирует протеины, но не действует на нуклеиновые кислоты, удаляют все белки, в том числе белки нуклеоида. Другие органические соединения клетки и низкомолекулярные вещества теряются при высаживании ДНК этанолом, поскольку остаются в растворе. Полученный в результате центрифугирования образца осадок нуклеиновых кислот, дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой, растворяют в специальном буфере для хранения ДНК – буфере TE. Входящий в его состав хелатирующий агент – этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) предотвращает воздействие на ДНК клеточных нуклеаз, поскольку связывает необходимые для их работы катионы Mg 2+.
Материалы и оборудование Основное оборудование для проведения молекулярно-биологических исследований: микроцентрифуга, центрифуга для больших объёмов, термостатируемая качалка-шейкер, вортекс, термостат, источник тока, камеры для электрофореза, УФ-трансиллюминатор, термостат твердотельный для микропробирок, pH-метр, ДНК-амплификатор, электропоратор, спектрофотометр, микропипетки-дозаторы с одноразовыми наконечниками. Для проведения практических работ необходимо также следующее лабораторное оборудование: ламинарный бокс, вытяжной шкаф, сушильный щкаф, холодильник, морозильник, весы, дистиллятор, электроплитка, СВЧ-печь, УФ облучатель, лабораторный пластик и посуда. Для работы 1.1 необходим штамм энтеробактерии кишечной палочки Escherichia coli XL1–Blue ( StratageneTM ) или штамм почвенной бактерии азоспириллы Azospirillum brasil е nse Sp245. Характеристики используемых в практикуме бактериальных штаммов и плазмид приведены в приложениях. Растворы - Среда 2YT.На 1 л: триптон – 16 г; дрожжевой экстракт – 8 г; NaCl – 5 г. Довести до 1 л дистиллированной водой, рН среды 7, 0. Для получения твёрдой среды в неё добавляют перед автоклавированием агар до 1, 5%. - 5% SDS. 5%-ный раствор додецилсульфата натрия (лаурилсульфата, саркозила, N-laur y lsarcosine) в буфере ТЕ. - Проназа.Раствор 5 мг/мл в буфере ТЕ. - Буфер TE.10мМ Тris–HCl, pH 8, 0; 1мМ ЭДТА. - 5М NaCl. Растворить 292, 5 г NaCl в 800 мл воды и довести объём до 1 л. - Смесь фенол–хлороформ.Водонасыщенный фенол (насыщенный после перегонки 0, 1M Tris–HCl, pH 8, 0) смешивают в пропорции 1: 1 с заранее приготовленной смесью хлороформ–изоамиловый спирт. - Смесь хлороформ–изоамиловый спирт. Вещества смешивают в пропорции 24: 1 по объёму. Методика 6. Произвести отдельной колониейпосев бактерий штамма E. coli XL1–Blueпробирку с 5 мл жидкой питательной среды 2YT и растить культуру бактериальных клеток в течение ночи с аэрацией при 37°С а. 7. Перенести микропипеткой 1, 5 мл культуры в микроцентрифужную пластиковую пробирку типа Eppendorf объёмом 1, 7 мл. Осадить клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин. Это наиболее часто используемая скорость для микроцентрифуги, её устанавливают по умолчанию, если не указана другая скорость. 8. Удалить супернатант (вылить питательную среду через край: не бойтесь! осадок плотный). Добавить к осадку 300 мкл буфера ТЕ и с помощью микропипетки перевести клетки в суспензию вновь (ресуспензировать). 9. Добавить к суспензии клеток 100 мкл 5%-ного раствора SDS и перемешать переворачиванием пробирки 3 раза. 10. Добавить 150 мкл р-ра проназы (5мг/мл) и перемешать. 11. Инкубировать 1 (0, 5) ч в термостате при температуре 37°С. Происходит лизис клеток и ферментативный гидролиз белков. 12. Высадить нуклеиновые кислоты из лизата спиртом. Для этого добавить в пробирку равный объём изопропанола (550 мкл) и центрифугировать в течение 10 минут. (После добавления спирта при необходимости можно прерваться; не центрифугировать пробу сразу, а убрать её в холодильник. «Под спиртом» ДНК может храниться долгое время). 13. После центрифугирования отобрать микропипеткой остатки жидкости из пробирки. Растворить осадок нуклеиновых кислот в 500 мкл буфера ТЕ и провести окончательную депротеинизацию образца, т.е. очистку ДНК от белков (пп. 9–12). 14. Добавить к раствору равный объём (500 мкл) смеси фенол–хлороформ и хорошо встряхнуть до образования стойкой эмульсии. 15. Разделить водную и органическую фазы путём центрифугирования в течение 5 мин. Фенол остается внизу, водная фаза с растворённой ДНК – вверху. Денатурированные фенолом белки диссоциируют с ДНК, теряют растворимость и собираются при центрифугировании на границе раздела фаз – в интерфазе. Т.е. идёт экстракция ДНК из ДНП-комплекса. 16. Перенести микропипеткой водную фазу, содержащую ДНК, в чистую 1, 7 мл пробирку. При отборе важно не засасывать наконечник интерфазу – плотный слой белёсого цвета между водной и органической фазами в которой находятся агрегаты денатурированных молекул белков б. 17. Провести ещё одну экстракцию ДНК хлороформом и избавиться от примеси фенола. Для этого добавить в пробирку с образцом равный объём смеси хлороформ–изоамиловый спирт, перемешать и центрифугировать в течение 3 мин. Водную фазу перенести в чистую пробирку. 18. Оценить микропипеткой-дозатором или по меткам на пробирке получившийся объём водной фазы и добавить 1/25 объёма 5М NaCl до конечной концентрации соли 0, 2M. Затем добавить 2, 5 объёма холодного (–20°С) этанола для осаждения ДНК, точнее её натриевой соли. Оставить на 1–2 ч в морозильнике при температуре –20°С. Можно оставлять ДНК под спиртом и дольше, до того времени как образец потребуется. 19. Осадить нуклеиновые кислоты центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Слить супернатант и промыть осадок. Для этого добавить к осадку 1 мл холодного 70% этанола и снова центрифугировать в течение 3 мин в. 20. Слить 70% этанол, перевернуть пробирки на фильтровальную бумагу. После того как вся жидкость стечет, пробирку с осадком нуклеиновых кислот (ДНК и РНК г) немного подсушить на воздухе до исчезновения запаха спирта д. Растворить осадок в 50 мкл буфера ТЕ. Для электрофореза ДНК (тема 3) достаточно 5–10 мкл образца. Примечания а О выращивании бактерий см. в руководствах по микробиологии. Некоторые сведения представлены в данном пособии только там, где это необходимо. б Некоторый объём водной фазы при этом неизбежно теряется, до 1/5 объёма. На практике лучше пожертвовать этим объёмом сейчас, чем чистотой препарата впоследствии. Фенол – токсичное раздражающее вещество, необходимо исключить контакт с кожей и работать с микроколичествами, соблюдая меры предосторожности. в Допускается просто слить 70 % спирт, без центрифугирования. г Избавиться от РНК при необходимости можно с помощью фермента РНКазы (см. работу 4.1). Примесь РНК в препарате ДНК не влияет на рестрикцию или ПЦР. д Пересушивать осадок нельзя, в полностью высушенном виде он практически нерастворим в воде. Обычно осадки сушат на открытом воздухе не более получаса, под потоком нагретого воздуха или в твердотельном микротермостате достаточно 5 мин.
Работа 1.5. Выделение ДНК из лимфоцитов
Изоляция общей ДНК из клетки не представляет особой сложности, поскольку плазмалемма, ядерная и митохондриальная мембраны «растворяются» в присутствии анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), а сложной клеточной стенки у животных в сравнении к примеру с растениями нет (см. работу 2.2). Высвободить ДНК из ДНК-белкового комплекса можно с помощью протеиназ или хаотропных солей. Материалы и оборудование Образцы крови, микроцентрифуга, морозильник, термостат, микро-пипетки-дозаторы с наконечниками, микропробирки пластиковые. Растворы - Буфер SSC.3M NaCl; 0, 3M цитрат натрия, pH 7, 0. Для приготовления концентрированного 20´ SSC на 1 л нужно взять: NaCl – 175, 3 г; цитрат натрия – 88, 2 г. pH раствора доводить обычно не требуется. - Смесь хлороформ–изоамиловый спирт (работа 1.1). Методика 1. К 100 мкл цельной крови а добавить 2 объёма дистиллированной воды до конечного объёма 0, 3 мл. Тщательно перемешать и оставить на 15 минут. 2. Пробу центрифугировать в течение 10 минут, 5000 об/мин. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) слить.
Примечания а Содержание общей ДНК в лейкоцитах составляет 30–60 мкг/мл крови. б Соль всегда нужно добавлять к образцу до фенольной депротеинизации, т.к. экстракция фенолом в низкосолевом буфере может снизить выход ДНК из-за потерь.
Работа 1.5. Выделение ДНК из растительных тканей
.При выделении ДНК из тканей растений наиболее значимым фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов в ее цепях! ). Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и её количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК.
Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счёт связывания двухвалентных катионов. Препараты растительных клеток, полученные таким путем, содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Кроме того, растительная ДНК неизбежно фрагментируется при выделении.
От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат всё ещё сильно загрязнён полисахаридами.
Если требуется большое количество чистой ДНК, то образцы очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия.
Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl a мм onium bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием СTAB (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со CTAB. При снижении концентрации соли ниже 0, 4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов CTAB /нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисаха-ридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе 1М NaCl и высаживают ДНК спиртом.
Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы). Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Dellaporta et al., 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при 0°С образуют комплексы с SDS и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осаждённая спиртом и растворённая в соответствующих буферах пригодна для рестрикции и ПЦР. Материалы и оборудование Растения кукурузы, петунии, табака (или замороженные ткани), микроцентрифуга, морозильник, ступки с пестиками, оксид алюминия, песок. Растворы - Буфер для экстракции.100мM Tris–HCl, pH 8, 0; 50мM ЭДТА; 500мM NaCl; 1, 25% SDS; 8, 3мM NaOH; 0, 83% Na2S2O3. - 3М ацетат калия, рН 5, 0. На 100 мл: 5M ацетат калия – 60 мл; CH3COOH ледяная – 11, 5 мл; H2O – 28, 5 мл. - Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1). - Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1). Методика 1. Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при –20°С в морозильнике. Либо быстро заморозить навеску в жидком азоте. 2. Образцы растереть в предварительно охлаждённой фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0, 1 г оксида алюминия или прокалённого белого речного песка a в качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл). 3. Добавить в ступку 700 мкл буфера для экстракции, снова перемешать. 4. Перенести растёртую массу в 1, 7 мл микропробирку так, чтобы объём составлял примерно 700 мкл (на пробирке есть метка 0, 75 мл). 5. Перемешать и инкубировать гомогенат при 65°С в течение 10 минут. 6. Добавить 220 мкл ацетата калия и поместить пробирку на лёд на 20 минут. 7. Центрифугировать пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант (надосадочную жидкость) в чистую пробирку. 8. К супернатанту добавить равный объём изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК. 9. Осадок ДНК промыть 70% этанолом, растворить в 200 мкл буфера ТЕ. 10. Провести процедуру фенольной депротеинизации образца. Для этого внести в пробирку с раствором ДНК равный объём фенол–хлороформной смеси, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить ту же процедуру со смесью хлороформ–изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК в чистую пробирку б. 11. Высадить ДНК в 2, 5 объёмами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объёма 3М ацетата K (рН 5, 0) или Na (pH 5, 2). 12. Пробу центрифугировать в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. 13. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 50 мкл буфера ТЕ г.
Примечания а По нашему опыту лучше использовать песок, мацерирующий ткани растений быстрее. Примесь песка или Al2O3 уйдет из образца при первом центрифугировании. б После экстракции белков фенолом и хлороформом всегда уменьшается объём водной фазы. Небольшое нарушение объёмной пропорции 1: 1 на деле не очень важно, однако на практике лучше этим не пренебрегать. Если водной фазы останется слишком мало (меньше 100 мкл) требуется перед хлороформом добавить ТЕ-буфер до исходного объёма, иначе потом будет неудобно отбирать верхнюю фазу и потери ДНК возрастут. в При методе с использованием SDS получается высокомолекулярная ДНК со средним размером фрагментов около 50 kb (kilo base pairs, тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). В препарате – хромосомная, хлоропластная и митохондриальная ДНК, а также РНК. г В буфере ТЕ можно хранить ДНК в холодильнике при +4°С сроком до нескольких месяцев. Для более длительного хранения ДНК в замороженном виде её растворяют в бидистиллированной или деионизованной воде. Использовать воду вместо ТЕ-буфера удобно, поскольку не будет необходимости переосаждать ДНК перед постановкой реакций, требующих ионов Mg2+, необходимых специфичным к ДНК ферментам. Однако замораживание-размораживание неизбежно ведёт к одно-/двух-цепочечным разрывам в цепи ДНК. Лучше всего из буфера ТЕ исключить ЭДТА и заморозить в нём, поскольку бидистилят, к примеру, имеет слабокислый показатель pH, что для ДНК нежелательно. В глубокой заморозке при –70°С можно заложить ДНК на хранение на годы.
Работа 1.4. Введение плодовых деревьев в культуру клеток и тканей
Пояснение Большинство плодовых деревьев умеренной зоны климата относятся к семейству Розоцветные. Тем не менее, скрещивания в условиях дачных участков в садовых товариществах возможны только между близкородственными породами. Это сильно ограничивает возможности селекционеров. Все потенциально возможные комбинации проверены многократно и эти возможности уже исчерпаны.
Скрещивания изолированных протопластов в условиях суспензионных культур при совместном культивировании двух или более образцов клеток в одной колбе на роторной качалке-шейкере позволяет преодолевать межвидовые и межродовые барьеры. Появляется возможность осуществлять объединение водной клетке трех-, четырёх- и более геномов в разнообразных комбинациях. Нужно заметить, что для многих существующих культурных растений полиплоидность – обычное явление. Так, твердые пшеницы имеют гексаплоидный геном - два генома от древних пшениц и один из эгилопса.
После нескольких дней совместного культивирования суспензию клеток высевают на агаризованные пительные среды с селективными агентами. Отдельные клеточные клоны формируют клеточную стенку и образуют отдельные колонии микрокаллуса. Перенеся микрокаллусы на питательный MS-агар с цитокининами добиваются органогенеза (с последующим укоренением), а с ауксинами – ризогенеза. Полученные через несколько недель фертильные растения – родоначальники новых сортообразцов и сортов. Такие технологии микроразмножения и селекции растений относятся к “суперинтенсивным”.
Материалы и оборудование
Растения яблони, груши, алычи, персика, шарафуги и др. (или замороженные ткани), микроцентрифуга, морозильник, целлюлаза и другие пектолитические ферменты (либо жидкость из-под прорастающих зерен ячменя или пшеницы), ступки с пестиками, оксид алюминия, песок (для мацерации тканей с целью получения суспензионных культур изолированных протопластов). Жидкая питательная среда для растений Мурасиге-Скуга (Murashige-Scoog, 1962). Растворы - Буфер для экстракции.100мM Tris–HCl, pH 8, 0; 50мM ЭДТА; 500мM NaCl; 1, 25% SDS; 8, 3мM NaOH; 0, 83% Na2S2O3. - 3М ацетат калия, рН 5, 0. На 100 мл: 5M ацетат калия – 60 мл; CH3COOH ледяная – 11, 5 мл; H2O – 28, 5 мл. - Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1). - Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1). Методика 1.Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при –20°С в морозильнике. Либо быстро заморозить навеску в жидком азоте. 3. Образцы растереть в предварительно охлаждённой фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0, 1 г оксида алюминия или прокалённого белого речного песка a в качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл). 4. Перенести весь материал в колбу с 200 мл питетельной среды MS и поместить на качалку-шейкер. 5. Инкубировать несколько суток при температуре 25-30 С. При 150-180 об/мин. 6. Перенести по 200-500 мкл суспензии из колб на питательный МS-агар для формирования клеточных стенок отдельными протопластами (клонами с объединенным геномом из двух или нескольких исходный клеток скрещиваемых плодовых культур). 7. Тщательно растереть стерильным шпателем помещенную суспензию по поверхности чашки Петри. Шпатель должен передвигаться с трудом после всасывания жидкости в агар! 8. Инкубировать чашки Петри в термостате при 28 С в течение полутора-двух недель для образования микрокаллусов. 9. Перенести отдельные микрокаллусы на селективные среды для регенереции отдельных растений (организмов с новыми хозяйственно- ценными признаками и свойствами).
Примечания а Любая ДНК и РНК в растворе (коллоидном) это не кислота, а соль. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473—497.
Тotal concentration Micro and Macro elements including vitamins: 4405.19 mg/l
Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant, 15, 473 (1962).
Работа 1.4. Концентрирование препаратов ДНК
Наиболее часто используемый метод концентрирования ДНК – осаждение этанолом. Растворив полученный осадок в меньшем объёме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит её дополнительная очистка. Материалы и оборудование Образец ДНК любого происхождения с низкой концентрацией, микроцентрифуга, гликоген. Растворы - 96% и 70% этанол. - 5 M NaCl. Растворить 292, 5 в воде, доведя объём до 1 л. - 3 M ацетат натрия, pH 5, 2 (тема 1). - Раствор гликогена в воде 10 мг/мл.
Методика 1. Довести концентрацию соли в препарате до 0, 2М NaCl (или до 0, 3M ацетата натрия), используя концентрированные стоковые растворы этих солей. Чаще всего к раствору ДНК добавляют 1/25 объёма 5М NaCl или 1/10 объёма 3М ацетата натрия, pH 5, 2, поскольку эти растворы всегда есть под рукой у исследователя ДНК и белков б. Примечания а Любая ДНК и РНК в растворе (коллоидном) это не кислота, а соль нуклеиновой кислоты. И катион у неё тот же, что и у соли, в присутствии которой она осаждалась. Тема 3. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ ПРЕПАРАТОВ ДНК, РНК И БЕЛКОВ
Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК в первом приближении дают при гель-электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации.
Определить концентрацию ДНК, а также степень её чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации ДНК в 50 мкг/мл. Для расчёта можно воспользоваться калькулятором на интернет-ресурсе MOLBIOL.RU (http: //www.molbiol.ru) или других подобных порталах.
Спектрофотометрия (абсорбционная) – физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм), видимой (400– 760 нм) и инфракрасной (> 760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии – зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны λ. В сооответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества.
Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290 нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания НК, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ свет примерно в 10 – 20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин.
Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1, 8, значение А260/235 должно быть больше, чем 2, 2. Загрязнение полисахаридами характерно, главным образом, для препаратов растительной ДНК. В состав лигнина, в отличие от других углеводов, входят ароматические группировки атомов, и поэтому лигнин поглощает УФ излучение.
Работа 3.1. Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК Нижний предел концентрации ДНК, которую можно определить спектрофотометрически, составляет 0, 1 мкг/мл. На определение обычно берут аликвоту (лат. a liquoties – несколько частей, кратный) исследуемого раствора ДНК, к примеру, 1 мкл и разбавляют в 100 и более раз.
Затем пересчитывают полученное значение концентрации раствора. Важно, чтобы в разведённом образце было более 10 нг ДНК. Для сравнения, при гель-электрофорезе также можно визуализировать полоску, содержащую от 10 нг ДНК. В образце ДНК не должно быть РНК. Материалы и оборудование Геномная ДНК из бактерий, клеток крови или тканей кукурузы с неизвестной концентрацией, спектрофотометр, образец ДНК любого происхождения с известной концентрацией. Растворы - Раствор ДНК с неизвестной концентрацией в буфере ТЕ. - Раствор ДНК фага лямбда в буфере ТЕ с концентрацией 1 мг/мл.
Методика 1. Взять микропипеткой на анализ 1 мкл образца полученной ДНК и разбавить препарат, добавив 130 мкл буфера ТЕ, содержащего 100мМ NaCl а. Объём образца делают равным 130 мкл, чтобы кривизна поверхности жидкости не влияла на измерения. 2. Поместить образец разбавленной ДНК в «маленькую» (100 мкл) ячейку. 3. Измерить поглощение А260. Полученное значение должно лежать в пределах 0, 005–2, 5 б. В противном случае нужно разбавлять или концентрировать ДНК в. 4. Рассчитать концентрацию ДНК, используя коэффициент пересчёта из табл. 1 по формуле: С[мкг/мл] = А260 ´ K
Таблица 1. Расчёт концентрации ДНК и РНК
5. Измерить поглощение А280 и А235, чтобы оценить степень очистки ДНК от примеси белков и полисахаридов. Отношение 260/280, также как и 260/235 должно быть больше чем 1, 8. Для чистой ДНК характерны значения А260/А280 = 1, 8 – 1, 9 и А260/А235 = 2, 2 – 2, 5. Для чистой РНК значение А260/А280 = 1, 9 – 2, 0 д. 6. Откройте главную страницу сайта MOLBIOL.RU (http: //www.molbiol.ru). На главной странице найдите раздел «Расчёты», выберите пункт «Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК (РНК)» и рассчитайте концентрацию вашего образца с помощью специальной формы. Примечания а Для растворения ДНК (РНК) можно использовать другие низкосолевые буферы, но только не воду. К примеру, растворы 100мM NaCl, 20мM Na3PO4, 10–100мM Tris–HCl (pH 7, 5–9, 0) или 100мM K2HPO4 (pH 8, 2) дают сходные результаты. Измерен |
Последнее изменение этой страницы: 2020-02-16; Просмотров: 252; Нарушение авторского права страницы