Определение амилолитической активности фермента

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 7Следующая ⇒

Для проведения испытания берут две пробирки, наливают в каждую по 10 см³ 1% крахмала и ставят в ультратермостат или водяную баню при (30±0, 2)°С на 5-10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую пробирку 5 см³ дистиллированной воды (контрольная), а во вторую – 5 см³ ферментного раствора (опытная). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин (по секундомеру).

Через 10 мин из реакционных смесей (контрольного и опытного растворов) отбирают по 0, 5 см³ раствора и переносят каждый в одну из колб с предварительно налитым 50 см³ рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают.

Полученные растворы приобретают следующую окраску:

Контрольный раствор – синий цвет, опытный раствор – фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала.

Непосредственно после смешивания растворов фотоэлектроколориметром определяют их оптическую плотность с максимумом светопропускания при λ = 656 нм, пользуясь кюветами с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Контрольным раствором при колориметрировании исследуемых растворов является дистиллированная вода.

Оптическая плотность контрольного раствора (D₁) соответствует количеству исходного крахмала-субстрата. Оптическая плотность опытного раствора (D₂) соответствует количеству крахмала, оставшегося после действия фермента.

Разница между показателями оптических плотностей растворов соответствует прогидролизованному количеству крахмала-субстрата.

Количество прогидролизованного крахмала (С) в граммах определяют по формуле [4.1]:

[4.1]

где: D₁ – оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ – оптическая плотность опытного раствора;

0, 1 – количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г.

Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0, 02 г или больше 0, 07 г, то испытание повторяют. При приготовлении рабочего раствора фермента берут большее или меньшее количество исходного раствора для разбавления.

Если в результате ферментативной реакции количество превращенного крахмала находится в указанных пределах, полученные данные используют для расчета амилолитической активности.

Амилолитическую активность в ед/г препаратов бактериального происхождения (АС) определяют по формуле [4.2]:

[4.2]

1000 – коэффициент пересчета милиграмма в грамм;

5, 885; 0, 001671– коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества прогидролизованного крахмала от количества фермента, взятого для испытания.

Содержание отчета, форма и правила оформления отчета о выполненной работе

Отчет по лабораторной работе оформляется в тетради и содержит: название, цель работы; описание метода определения амилолитической активности фермента; результаты собственных исследований вывод по работе.

Контрольные вопросы и защита работы

1. Классификация ферментов, их функции.

2. Основные типы специфичности ферментов.

3. Механизм действия ферментов.

4. Сущность метода определения амилолитической активности ферментов.

5. Характеристика амилолитических ферментов

6. Применение амилолитических ферментов в пищевой промышленности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВМОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ АНСОНА

Цель работы: освоить метод определения протеолитической активности ферментных препаратов.

Теоретическое положение

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются производными понятиями удельной и молярной активности.

Удельную активностьфермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в секунду, принято называть числом оборотов, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента).

Если фермент содержит характерную простетическую группу или несколько каталитических центров, которые поддаются измерению, его активность можно выразить в величинах активности каталитического центра. Такая активность будет соответствовать молекулярной активности, если молекула фермента имеет один активный центр; если же число каталитических центров n, то активность одного центра будет в n раз меньше молекулярной.

Активность условного препарата. В технологии ферментов помимо общепринятых понятий об активности ферментных препаратов принято пользоваться понятием активности условного ферментного препарата. Это необходимо для оценки работы предприятия, сравнения его с другими аналогичными заводами, т. е. для сопоставления показателей по всем видам выпускаемой продукции. Для осуществления этого пересчета предполагают, что предприятие выпускает товарную продукцию в виде стандартного препарата с точно определенной активностью, измеряемой по основному ферменту в стандартных единицах в препарате на единицу массы препарата. Активность основного фермента в таком стандартном условном препарате устанавливается нормативами и называется активностью условного препарата.

За 1 усл.т ферментного препарата принимается 1 т препарата со стандартной активностью. Для пересчета выработанной товарной продукции в условные тонны можно пользоваться формулой [5.1]:

Q_усл = Q_тов*А_ф/_Аусл,

[5.1]

где: Q_усл – количество условного препарата, т;

Q_тов – количество товарного препарата, т;

А_ф – фактическая активность товарного препарата, ед/г;

А_усл – активность условного препарата, ед/г.

Протеолитическая активность (ПС) характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г препарата.

За единицу протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30°С превращают в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеинат натрия в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0, 181 мг); активность выражается в ед/г.

Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона (по ГОСТ 20264.2) основано на гидролизе белка казеината натрия препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Активность бактериальных протеиназ определяют при следующих значениях рН: 2, 5 ± 0, 2 – кислые протеиназы; 7, 2 ± 0, 2 –нейтральные протеиназы; 9, 5 ± 0, 2 –щелочные протеиназы.

Аппаратура, оборудование и материалы:

Приборы и оборудование – ультратермостат, фотоэлектрокалориметр, весы аналитические, магнитная мешалка, плитка, водяная баня.

Реактивы и материалы –0, 01 М, 0, 1 и 0, 5 М универсальный буферный раствор; 0, 3 М раствор ТХУ; 1н НС1; 0, 2 н НС1; 0, 5 М NaCO₃; реактив Фолина (1: 2); протеолитические ферментные препараты (пепсин, панкреатин, сычужный фермент), тирозин, казеинат натрия, 1 н уксусная кислота; 1 н уксуснокислый натрий; бумажные фильтры;

Посуда – пробирки, химические стаканы емк. 100 см³, мерные колбы емкостью 50 см³, мерные колбы емкостью 100 см³, стеклянные палочки, воронки

Порядок выполнения работы:

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 Следующая ⇒