Определение протеолитической активности фермента

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 7Следующая ⇒

2 см³ субстрата вливают в пробирку и помещают в ультратермостат при 30°С. Через 10 мин в пробирку приливают 2 см³ раствора фермента, пробирку встряхивают и оставляют на 10 мин при 30°С для проведения процесса гидролиза.

Через 10 мин добавляют в пробирку 4 см³ 0, 3 М раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирку со смесью при 30°С еще 20 мин. Затем фильтруют через маленькую воронку с бумажным фильтром в сухую пробирку. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным. Затем отбирают в пробирку 1 мл фильтрата, добавляют 5см³ 0, 5 М раствора углекислого натрия, перемешивают и быстро при непрерывном перемешивании приливают 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции раствор приобретает голубую окраску, интенсивность которой определяют фотоэлектроколориметром против контрольной пробы.

Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: для этого к 2 см³ ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 см³ 0, 3 М раствора ТХУ, выдерживают в ультратермостате при 30°С 10 мин, а затем вносят 2 см³ субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отбирают в сухую пробирку 1 см³ фильтрата, при перемешивании вносят 5 см³ 0, 5 М раствора углекислого натрия и 1 см³ рабочего раствора реактива Фолина. Колориметрирование производят фотоэлектроколориметром при длине волны λ = 656-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Построение градуировочной кривой

Для расчета протеолитической активности необходимо построить градуировочную кривую по тирозину. Затем по градуировочной кривой вычислить тирозиновый эквивалент, т.е. ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см³ стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждой новой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектроколориметра.

Для построения градуировочной кривой готовят раствор тирозина концентрации 10^{-3 М. Для этого 181, 19 мг чистого тирозина растворяют в 0, 2 н растворе НС1 в мерной колбе емкостью 1 дм3}. Из этого исходного раствора тирозина готовят дальнейшие разведения следующим образом.

Раствор 1. В мерную колбу емкостью 50 см³ вносят 1 см³ исходного раствора тирозина и доводят объем до метки 0, 2 н раствором НС1. Концентрация тирозина (С₁) при этом составляет 0, 2 10^{-4 М или 0, 02 мкмоль/ см3}.

Последующие растворы готовят аналогичным образом:

Раствор 2. 2 см³ исходного раствора С₂ – 0, 4 10^{-4 М или 0, 04 мкмоль/ см3};

Раствор 3. 4 см³ исходного раствора С₃ – 0, 8 10^{-4 М или 0, 08 мкмоль/ см3};

Раствор 4. 5 см³ исходного раствора С₄ – 1, 0 10^{-4 М или 0, 10 мкмоль/ см3};

Раствор 5. 7, 5 см³ исходного раствора С₅ – 1, 5 10^{-4 М или 0, 15 мкмоль/см3};

Раствор 6. 10 см³ исходного раствора С₆ – 2, 0 10^{-4 М или 0, 20 мкмоль/ см3};

Раствор 7. 15 см³ исходного раствора С₇ – 3, 0 10^{-4 М или 0, 30 мкмоль/ см3}.

Затем в пробирки вносят по 1 см³ раствора тирозина разной концентрации. Добавляют в них при постоянном помешивании по 5 см³ 0, 5 М раствора углекислого натрия и 1 см³ рабочего раствора Фолина.

Контрольный опыт готовят также, но вместо раствора тирозина берут 1 см³ дистиллированной воды. Дают реакционной жидкости постоять 20 мин. Интенсивность окраски измеряется фотоэлектроколориметром против контрольной пробы при длине волны λ = 656-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Следует приготовить растворы из двух навесок тирозина и провести описанным выше способом два параллельных опыта. По средним данным, полученным из двух опытов, строится градуировочная кривая. На оси абсцисс откладывается количество тирозина (С) в мкмоль/ см³, на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности (D).

Протеолитическую активность (ПС) в ед/г или ед/ см³ вычисляют по формуле:

[5.2]

где: D – оптическая плотность, измеренная на фотоэлектроколориметре при толщине поглощающего свет слоя 10 мм;

4 – отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления ТХУ;

ТЭ – тирозиновый, определяемый по градуировочной кривой;

10 – время гидролиза субстрата, мин;

m – количество ферментного препарата, взятого на протеолиз (в мг на 1 см³ ферментного раствора);

1000 – переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата.

Содержание отчета, форма и правила оформления отчета о выполненной работе

Отчет по лабораторной работе оформляется в тетради и содержит: название, цель работы; описание метода определения амилолитической активности фермента; результаты собственных исследований вывод по работе.

Контрольные вопросы и защита работы

1. Определение активности ферментов (единицы активности, удельная и молярная активности).

2. Активирование и ингибирование ферментов.

3. Сущность модифицированного метода Ансона.

4. Характеристика протеолитических ферментов животного происхождения.

5. Характеристика протеолитических ферментов растительного происхождения.

6. Применение протеолитических ферментов в пищевой промышленности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СТАБИЛИЗАТОРОВ

Цель работы: определить качественные показатели различных стабилизаторов применяемых в молочной промышленности.

Теоретические положения

К группе пищевых добавок, изменяющих структуру и физико-химические свойства пищевых продуктов, могут быть отнесены вещества, используемые для создания необходимых свойств или изменения существующих реологических свойств пищевых продуктов, т. е. добавки, регулирующие или формирующие их консистенцию. К ним принадлежат добавки различных функциональных классов - загустители, гелеобразователи, стабилизаторы физического состояния пищевых продуктов, поверхностно-активные вещества (ПАВ), в частности, эмульгаторы и пенообразователи.

Химическая природа пищевых добавок, отнесенных к этой группе, достаточно разнообразна. Среди них имеются продукты природного происхождения и получаемые искусственным путем, в том числе химическим синтезом. В пищевой технологии они используются в виде индивидуальных соединений или смесей.

В последние годы в группе пищевых добавок, регулирующих консистенцию продукта, большое внимание стало уделяться стабилизационным системам, включающим несколько компонентов: эмульгатор, стабилизатор, загуститель. Их качественный состав, соотношение компонентов могут быть весьма разнообразными, что зависит от характера пищевого продукта, его консистенции, технологии получения, условий хранения, способа реализации. Применение в современной пищевой технологии таких добавок позволяет создать ассортимент продуктов эмульсионной и гелевой природы (маргарины, майонезы, соусы, пастила, зефир, мармелад и др.), структурированных и текстурированных пищевых продуктов.

Загустители и гелеобразователи, введенные в жидкую пищевую систему в процессе приготовления пищевого продукта, связывают воду, в результате чего пищевая коллоидная система теряет свою подвижность и консистенция пищевого продукта изменяется.

Подавляющее большинство загустителей и гелеобразователей со статусом пищевых добавок относится к классу полисахаридов (гликанов). Исключение желатин, имеющий белковую природу. Основные представители загустителей и гелеобразователей, относящихся к классу полисахаридов (гликанов): модифицированные крахмалы, целлюлозы, пектины, галактоманнаны, полисахариды морских водорослей.

Модифицированные крахмалы, в отличие от нативных растительных крахмалов, считающихся пищевыми продуктами, относятся к пищевым добавкам. По изменениям, происходящим в нативных крахмалах, можно выделить четыре основных типа модификаций: набухающие крахмалы, расщепленные крахмалы, стабилизированные крахмалы, сшитые крахмалы. Благодаря таким свойствам модифицированные крахмалы особенно эффективны в пищевых технологиях, включающих продолжительную термическую обработку, интенсивные механические воздействия, а также в технологиях, где требуется пролонгирование процессов набухания крахмальных гранул, повышения вязкости и формирования текстуры.

В группу пищевых добавок (гликано) в целлюлозной природы входят продукты механической и химической модификации и деполимеризации натуральной целлюлозы. Собственно целлюлоза используется в качестве пищевой добавки Е460 в двух модификациях: микрокристаллическая целлюлоза (частично гидролизованная, отличается укороченными молекулами); порошкообразная целлюлоза, выделенная из растительного сырья (древесины, хлопка и т. п.) путем удаления сопутствующих веществ (гемицеллюлоз и лигнина) и затем измельченная. Основные технологические функции целлюлозы – эмульгатор и текстуратор, добавка, препятствующая слеживанию и комкованию.

Пищевые добавки целлюлозной природы являются безвредными, поскольку не подвергаются в желудочно-кишечном тракте деструкции и выделяются без изменений. Дневной суммарный прием с пищей всех производных целлюлозы может составлять 0 – 25 мг на килограмм массы тела человека. Их дозировки в пищевых продуктах определяются конкретными технологическими задачами.

Традиционно эти добавки используются при изготовлении хлебобулочных и кондитерских изделий, молочных и низкожирных эмульсионных продуктов, а также безалкогольных напитков, где выступают в качестве эмульгаторов и стабилизаторов многокомпонентных дисперсных систем, суспензий и эмульсий, обеспечивают необходимые консистенцию и вкусовые свойства.

Пектины, наряду с галактоманнанами (гуаровой камедью и камедью рожкового дерева), являются основными представителями группы гетерогликанов высших растений. Пектинами называется группа высокомолекулярных гетерогликанов, которые входят в состав клеточных стенок и межклеточных образований высших растений. В настоящее время выпускается несколько видов пектинов, выделяемых из различных источников сырья и различающихся по составу и функциональным свойствам: высокоэтерифицированные (яблочный, цитрусовый), низкоэтерифицированные (свекловичный, из корзинок подсолнечника), а также комбинированные пектины из смешанного сырья различной степени этерификации. Из низкоэтерифицированных пектинов более востребованными являются неамидированные, которые используют при приготовлении, например, сухих киселей, диабетических кондитерских изделий.

Растительные галактоманны. Коммерческие препараты растительных галактоманнанов получили название камеди. Наиболее распространенными в качестве пищевых добавок в этой группе являются галактоманнаны семян двух видов растений – гуара, произрастающего в Индии и Пакистане, и рожкового дерева, произрастающего на побережье Средиземного моря. Эти камеди (Е410 и Е412) имеют сходное химическое строение и представляют собой нейтральные полисахариды. У камеди гуара, получившей название гуаран, остаток галактозы присоединен к каждому второму остатку маннозы, а у камеди из бобов рожкового дерева – к каждому четвертому.

Полисахариды морских водорослей. Коммерческие препараты этой подгруппы пищевых добавок объединяют полисахариды, выделяемые из красных и бурых морских водорослей. В пищевой промышленности широко используются альгинаты, каррагинаны и агароиды.

Агар (агар-агар) – смесь полисахаридов агарозы и агаропектина. Агар-агар получают из красных морских водорослей. Агар незначительно растворяется в холодной воде, но набухает в ней. В горячей воде он образует коллоидный раствор, который при охлаждении даст хороший прочный гель, обладающий стекловидным изломом. Гелеобразующая способность агара в 10 раз выше, чем у желатина. При нагревании в присутствии кислоты способность к гелеобразованию снижается. Гели стабильны при рН более 4, 5 и термообратимы.

Каррагинаны объединяют семейство полисахаридов (известное также под названием ирландский мох), содержащихся, наряду с агаром, в красных морских водорослях. Все виды каррагинанов растворимы в горячей воде, а в виде натриевых солей они растворимы и в холодной воде с образованием вязких растворов.

Желатин является практически единственным гелеобразователем белковой природы, который широко используется в пищевой промышленности. Желатин — белковый продукт, представляющий смесь линейных полипептидов с различной молекулярной массой, не имеет вкуса и запаха. Его получают из коллагена, содержащегося в костях, хрящах и сухожилиях животных. Желатин растворяется в воде, молоке, растворах солей и сахара при температуре выше 40°С. При охлаждении водного раствора желатина происходит повышение вязкости с переходом в состояние геля. Условиями образования геля являются достаточно высокая концентрация желатина и соответствующая температура, которая должна быть ниже точки затвердевания (примерно 30°С).

Эмульгаторы. В эту группу пищевых добавок входят вещества, которые, будучи добавленными к пищевому продукту, обеспечивают возможность образования и сохранения однородной дисперсии двух или более несмешивающихся веществ.

По химической природе молекулы классических эмульгаторов, являющихся поверхностно-активными веществами, имеют дифильное строение, содержат полярные гидрофильные и неполярные гидрофобные группы атомов, которые, связанными с неполярным соединительным звеном (основанием), отделены друг от друга и располагаются на противоположных концах молекулы. В зависимости от особенностей химической природы эмульгатора, а также специфики пищевой системы, в которую он вводится, некоторые из представителей этого функционального класса пищевых добавок могут иметь смежные технологические функции, например, функции стабилизаторов или антиоксидантов.

Общим свойством, объединяющим эмульгаторы и отличающим их от пищевых добавок других классов, является поверхностная активность.

Наиболее популярными в этой группе являются природные лецитины, имеющие синтетический аналог под названием аммониевые фосфатиды. Особенности эмульгирующих свойств фосфолипидов обусловлены способностью образовывать и поддерживать в однородном состоянии как прямые, так и обратные эмульсии, что распространяет их использование на все виды пищевых эмульсий: от майонезов и различных салатных соусов (прямые эмульсии) до маргаринов различного жирнокислотного состава.

Аппаратура, оборудование и материалы:

Аппаратура и оборудование – водяная баня, секундомер, керамические тарелки, весы, холодильник, термостат, вискозиметр Гепплера, миксер.

Реактивы и материалы – различные стабилизаторы и эмульгаторы (крахмал, желатин, промышленные стабилизаторы, агар-агар, пектин, лецитин), дистиллированная вода.

Посуда – химические стаканы, мерные цилиндры, керамические тарелки, ложки, стаканы вместимостью 0, 5 дм³.

Порядок выполнения работы

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 Следующая ⇒