Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с методами приготовления и окраски микропрепаратов для микроскопии.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Основные формы и размеры бактерий.

2. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий.

3. Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки.

Функциональное значение отдельных структурных компонентов.

4. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий. Химический состав. Функции.

5. Механизмы взаимодействия красителей с клеточной стенкой бактерий при окраске по Граму.

6. Методы изучения микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии. Простые и сложные методы окрашивания. Методы Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Нейссера, Бурри-Гинса, Романовского-Гимза.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

n приготовить препараты: живые (нативные), фиксированные;

n окрасить препараты простым методом и методом Грама.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

о механизмах окраски структурных компонентов бактерий: клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий, спор, капсул, жгутиков, включений.

Работа №1 Морфология прокариот

Цель: сравнить формы и размеры микроорганизмов (см. теоретическую справку - Морфология прокариот)

Результат:

Результат:

Результат:

Вывод:

Работа№2. Изучение структуры клеточной стенки

Цель: изучить структуру клеточной стенки бактерий; освоить технику приготовления фиксированных препаратов.

Схема строения бактериальной клетки:

А) Назвать обязательные компоненты бактериальной клетки и охарактеризовать их

Б) Дать характеристику перечисленных структурных компонентов бактериальной клетки, методы их выявления, охарактеризовать участие в процессах метаболизма и значение структур для процессов репродукции, биосинтеза белка, энергетической, регуляторной, адгезивной функциях клетки.

Структурные компоненты бактериальной клетки и их функции:

Постоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Клеточная стенка Гр + (пептидогликан, тейхоевые кислоты) Гр – ( пептидогликан, фосфолипиды, белки, ЛПС)	1) Скелетная 2) Защитная 3) Рецепторная 4) Антигенная 5) Адгезивная 6) Транспортная 7) Нарушение синтеза клеточной стенки ведет к образованию L-форм	Световая микроскопия, окраска по Граму
ЦПМ Двойной слой фосфолипидов с внедрёнными белками	1) Основной осмотический барьер 2) Участвует в регуляции роста и синтезе компонентов клеточной стенки 3) Транспорт питательных веществ в клетку и метаболитов из нее 4) Инвагинации участков ЦПМ - лизосомы - содержат ферменты, обеспечивающие биологическое окисление	Электронная микроскопия
Лизосомы Производные ЦПМ	1) Аналог митохондрий, у эукариот обеспечивают синтез АТФ и процессы дыхания 2) Участвуют в делении клетки 3) Участвуют в спорообразовании	Электронная микроскопия
Цитоплазма Сложная коллоидная система, состоит из воды, растворимых белков, РНК	Обеспечивает функционирование всех органелл	Электронная микроскопия
Рибосомы 70S	Отвечают за биосинтез белка	Электронная микроскопия
Нуклеоид Двунитевая молекула ДНК, замкнута в кольцо, плотно уложена в виде клубка	Расположен в центральной зоне бактерий (одна хромосома) – носитель генетической информации	Электронная микроскопия

Непостоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Капсула Слизистая структура, прочно связана с клеточной стенкой (полисахариды или полипептиды)	1) Защитная 2) Антигенная 3) Адгезивная	Световая микроскопия, окраска по Бурри, Бурри-Гинсу
Жгутики Состоят из белка-флагеллина, являющимся Н-антигеном Пили Состоят из белка	Обеспечивают движение бактерий Пили 1го порядка обеспечивают адгезию к поражаемой микробной клетки. Пили 2го порядка – конъюгационные, обеспечивают перенос частиц генетического материала от донора к реципиенту	В мазках «висячая капля», «раздавленная капля», при фазово -контрастной микроскопии Электронная микроскопия
Плазмиды Дополнительные факторы наследственности в виде замкнутых колец ДНК с небльшой молекулярной массой	1) Регуляторная – компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина 2) Кодирующая – внесение в бактериальную клетку новой генетической информации	Электронная микроскопия
Включения Гликоген, полисахариды, бета-оксимасляная кислота, полифосфаты (валютин)	Запас питательных веществ	Световая микроскопия. Валютин окрашивают по Леффлеру или Нейссеру
Спора Образуют Гр+ бактерии, из одной клетки образуется спора. Плотная многослойная оболочка, с большим содержанием кальция и липидов низким содержанием воды	Сохранение генетической информации, при неблагоприятных условиях. Расположена: - субтерминально - терминально - центрально	Световая микроскопия, окраска по Ожешко.

Схема построения клеточной стенки:

А) Что изображено на схеме?

Б) Охарактеризовать основные компоненты объекта

В) Дать функциональную характеристику компонентов

Г) Основные различия двух типов

Д) Медицинское значение приведенного анализа?

Работа№3. Техника приготовления нативных (живых) препаратов. Изучение подвижности микроорганизмов

Индивидуальная работа: приготовьте мазок из смеси культур стафилококка и кишечной палочки, с окраской по Граму (см. теоретитечскую справку – Техника приготовления препаратов)

Вывод:

Индивидуальная работа: изучение подвижности микроорганизмов

Результат

Вывод:

Теоретическая справка

К Работе№1

Морфология прокариот

Бактерии - это одноклеточные организмы растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Они относятся к прокариотам, видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Бактерии растут на искусственных питательных средах, размножение происходит бинарным делением.

Бактерии делятся

патогенные(паразиты)условно-патогенныенепатогенные (сапрофиты)

вызывают болезни челове- вызывают заболевания не вызывают забо-

ка, животных, растений при определенных усло- леваний

виях

Морфология - это форма, размер бактерий, расположение клеток в препарате. Различают три морфологических формы бактерий:

Различают три морфологических формы бактерий:

1) кокки 2) палочки 3) извитые

1. Кокки: форма - круглая

размер - мелкие

расположение в препаратах - 6 разновидностей:

а) микрококки б) диплококки в) тетракокки

гонококки пневмококки

г) сарцины в) стафилококки д) стрептококки

2. Палочковидные:

· форма - цилиндр

· размер: длина: толщина:

- крупные - толстые

- средних размеров - тонкие

- мелкие

· концы палочек – закругленные (кишечная палочка)

- прямые (сибиреязвенная палочка)

- в виде утолщения (дифтерийная палочка)

· расположение - беспорядочное

- в цепочку (стрептобактерии)

- попарно (диплобактерии)

- в виде римских цифр II, V, X и т.д.

3. Извитые: форма – спиралевидная:

1. спириллы,

2. кампилобактерии

Теоретическая справка

к Работе№3

Техника приготовления нативных (живых) препаратов

1. Приготовление мазка

1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды

культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят

непосредственно на стекло (без воды) небольшую каплю воды, в ко-

торой эмульгируют исследуемый

материал и распределяют по

площади около 2 см².

№ препарата пишут на лицевой стороне, а с обратной стороны местонахождения мазка обводят восковым карандашом.

2. Высушивание

на воздухе высоко над пламенем спиртовки

мазком вверх

3. Фиксация

Цель: - прикрепить микробов к стеклу

- обеззаразить патогенные микробы

- убитые микробы лучше окрашиваются

Методы

физическийхимический

- над пламенем спиртовки мазком - более щадящий по сравнению

вверх (3 раза круговыми движениями) с физическим: мазок погружа-

ют в фиксатор (этанол, ацетон, формалин и др.) на определенное время

4. Окраска

Методы

простыесложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько краси-

анилинового ряда - основным или телей (основная и вспомога-

кислым: - кислый фуксин тельные краски, обесцвечи-

-эозин вающие жидкости (этанол)

- метиленовый синий - метод Грама

- окраска по Нейссеру

- генциановый фиолетовый - Гинса-Бурри (выявление капсул)

- Циля-Нильсена (выявление

спор)

2) используются для изучения 2) используются для определе-

морфологии микроорганизмов ния не только морфологии, но

и химического состава и струк-

туры микробных клеток

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашен.

Методика окраски по Граму:

1 этап. Используется основная краска генциановый фиолетовый, затем раствор Люголя. Образуется прочное комплексное соединение «генциановый фиолетовый+йод». Все микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

2 этап. Обработка этанолом (дифференциация)

одни микробыдругие микробы

сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый

фиолетовый+йод, не обесцвечиваются фиолетовый+йод, обесцвечиваются. это связано с тем, что: объясняется тем, что:

-клеточная стенка толстая, -клеточная стенка микробов тонкая,

-в ее состав входит много пеп- -пептидогликана мало,

тидогликана,

-имеются тейхоевые кислоты - тейхоевых кислот нет

- по строению клеточная стенка - структура клеточной стенки

представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, поэтому

образование, поэтому после обра- после обработки этанолом поры

ботки этанолом поры клеточной остаются прежними, краска

стенки суживаются и краска не - вымывается, микробы обесцве-

вымывается. чиваются

3 этап. Окраска фуксином

одни микробыдругие микробы

остаются сине-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,

грамположительные: грамотрицательные:

1.Все кокки за исключением 1.Гонококки и менингококки

гонококков и менингококков

2.Все спорообразующие палочки 2.Большинство неспорообразующих

палочек

3.Из неспорообразующих бактерий 3.Спириллы

туберкулезная и дифтерийная палочки

4.Актиномицеты 4.Риккетсии

5.Грибы 5.Микоплазмы

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 м дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Методика окраски по методу Циля- Нильсена:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин;

2. Снять бумагу, промыть мазок водой;

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания;

4. Промыть водой;

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течении 3-5 мин;

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Методика окраски по методу Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0, 5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы- синий.

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 Следующая ⇒