Лабораторные термостаты, аэраторы и инкубаторы. Типы конструкций и возможности применения для разных типов клеток.

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований: 1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры; 2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему; 3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема; 4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением.

По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают. Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами. Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим. Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей.

СО₂-инкубаторы

Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам. Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем. Это так называемые углеки- слотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow».

Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям культивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО2- инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора. Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газо-проточные инкубаторы типа ГПИ-1, где подача нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содержание достигается изменением скорости протока.

Аэраторы

Для обеспечения аэрации культуральной среды - снабжения кислородом - используют воздух, а также воздух, обогащенный кислородом, реже - чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), зависят от газообразных субстратов и требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы - основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода.

Лабораторные встряхиватели

Большое значение в оснащении лаборатории, предназначенной для культивирования клеток, имеют приборы, обеспечивающие принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами, обеспечивая лучший газообмен и тем самым повышая эффективность культивирования. Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание в одном режиме - вращательном или возвратно-поступательном. Хотя наиболее современные модели (фирма «Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах перемешивания. Роллерные установки - аппараты, позволяющие успешно применять один из общепринятых методов культивирования клеток - выращивание их в цилиндрических сосудах из боросиликатного стекла с небольшим количеством питательной среды, вращающихся в горизонтальном положении со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоянное перемешивание питательной среды и интенсивный рост клеток. Для повышения эффективности массового культивирования установки обеспечены системой, дающей возможность заменять питательную среду и удалять супернатант без остановки вращения. Для этого сосуды снабжаются специальными перфузионными пробками, в которых центральная часть вращается независимо от периферийной. В эту часть пробки вводятся трубки для смены питательной среды, удаления супернатанта и введения инокулята. В состав данной системы также входят перистальтические насосы и блок автоматики, регулирующий их работу.

Аппараты для массового культивирования клеток. Типы, режимы работы и возможности использования для культивирования клеток.

В зависимости от конструктивных решений, объемов и других характеристик биореакторы делят на группы.

На основе рабочего объема биореакторы делятся на лабораторные (их емкость 0, 5-100 л), пилотные (100 л -10 м3) и промышленные (10-100 м3). Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда.

Все биореакторы могут быть разделены по используемому принципу культивирования на закрытые и открытые. В закрытых биореакторах осуществляют периодическое культивирование, иногда его называют накопительным культивированием.

По способу подачи воздуха в биореактор их можно разделить на 2 типа:

без подводки стерильного воздуха (в таких биореакторах культивируют анаэробные микроорганизмы);

с подводкой стерильного воздуха (их используют для культивирования аэробов). Аэрация жидкости в биореакторах может обеспечиваться механическими мешалками или потоком воздуха.

Ферментеры можно подразделить в зависимости от системы перемешивания на три основные группы: аппараты с механическим,

Барботажным,

эрлифтным перемешиванием.

Биореакторы с механическим перемешиванием характеризуются тем, что воздух подают под давлением через распределитель, представляющий собой кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания, обеспечивается их равномерное распределение внутри аппарата. Для этой же цели используются мешалки, которые, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа ее оборотов и физико-химических свойств используемой среды. При интенсивном перемешивании часто случается вспенивание, поэтому рабочий объём биореакторов такого типа не превышает 55 %.

Биореакторы с барботажной системой воздухораспределения характеризуются тем, что перемешивание в них осуществляется восходящими потоками воздуха, который подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора через барботеры, представляющие собой воздушные трубы с отверстиями диаметром 0, 1-0, 2 мм. Подача воздуха под сильным давлением приводит к сильному пенообразованию, поэтому рабочий объем биореакторов такого типа также не превышает 55 %.

Биореакторы с эрлифтной системой воздухораспределения характеризуются тем, что воздух подают через центральную трубу, которая обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости, либо за счет внешней системы циркуляции, которая осуществляется также с помощью труб, установленных снаружи аппарата.

По конструкции биореакторы классифицируются следующим образом:

реакторы емкостного типа;

реакторы типа колонны;

реакторы трубчатого типа;

реакторы пленочного типа;

реакторы мембранного типа;

реакторы с псевдоожиженным слоем.

Конструктивный тип реактора зависит от условий проведения процесса и свойств участвующих в нем компонентов.

Классификация ферментеров по способу подвода энергии:

Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ). Их общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая является ее носителем. Ферментеры характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой эксплуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные характеристики. Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость, снабженную газораспределительным устройством одного из известных типов.

К таким аппаратам относятся, например, барботажные и эрлифтные ферментеры.

Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ) наиболее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают наиболее высокие по сравнению с группой ферментеров ФГ значения коэффициента массопередачи кислорода.

В данных аппаратах ввод энергии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалками или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппараты также можно подразделит на типы:

ферментеры с самовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных аппаратов, так как поступление в них воздуха происходит в результате разрежения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с жидкостью, отбрасываемой лопатками мешалки;

в эжекционных ферментерах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, однако требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержащей культуральной среды.

Применение эжекционного ввода газовых субстратов в ферментер может интенсифицировать массообмен на порядок;

струйные ферментеры (с затопленной или падающей струей) оборудуются мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из нижней части аппарата. Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает аэрируемую жидкость до дна аппарата, интенсивно перемешивая жидкость. Внизу жидкость вновь засасывается насосом и снова подается вверх аппарата, то есть возникает замкнутый контур циркуляции.

Недостатком данных аппаратов являются потери энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы струйных и эжекционных устройств.

Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фазами (группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами являются перемешивающие устройства всех известных типов, обеспечивающие высокоэффективное диспергирование и гомогенизацию, а также наличие в совокупности насосов и перемешивающих устройств.

Это могут быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для перекачивания культуральной жидкости, высокоинтенсивные аппараты с механическим перемешиванием и одновременно барботажем сжатым воздухом и другие сочетания перемешивающих и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких ферментерах может в принципе иметь любые из известных значения.

Известны следующие основные типы аппаратов отечественного производства: барботажный (трубчатый и коробчатый), эрлифтный (типовой), эрлифтно-периферийный, эрлифтно-многозонный, многозонной конструкции, колонный, горизонтальный с самовсасывающими мешалками, эжекционный, дрожжерастильный и другие. Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены. Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ (ПАВ), Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль).

Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как, если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу.

Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика.

Для борьбы с избыточным пенообразованием используется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения.

Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования. Однако при добавлении этих веществ может изменяться состав питательной среды.

Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки.

А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны.

Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специальный ввод.

Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяются в процессах конверсии растительного сырья, а также различных промышленных отходов.

При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получение ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты ( метанотенки ).

Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров). Метанотенки оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменных труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема ( газгольдер ) для сбора образуемого биогаза.

5. Культуральная посуда. Особые требования к свойствам поверхности и материалу изделий из стекла и пластика. Специальная культуральная посуда. Области применения и возможность использования

Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.

Посуда из стекла

Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду бесспорных преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.

Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов - многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.

Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.

Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.

Пластиковая посуда

Начиная с 1965 г. все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма-лучами) или химическими (газы - окись этилена, жидкости - этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.

Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.

6. Аппараты для очистки воды, характеристика и возможности получения сверхчистой и общелабораторной воды. Приборы, аппараты иреактивы для мытья и стерилизации посуды.

Качество воды, используемой для приготовления питательных сред либо для мытья культуральной посуды, имеет важное значение. До недавнего времени такая вода приготавливалась путем простой и двукратной дистилляции питьевой воды. В настоящее время наряду с традиционными широкое применение получили методы очистки воды путем использования физико-химических процессов обратного осмоса, ионного обмена и мембранной фильтрации. Водопроводная вода, используемая в качестве исходной и прошедшая в этих установках через очистку обратным осмосом, поступает на фильтры из активированного угля, с них - на колонки с ионообменными смолами и затем - на мембранные фильтры с диаметром пор 0, 22 мкм. При необходимости вода дополнительно подвергается воздействию мощного потока УФ облучения.

Для очистки воды подобным способом наиболее часто применяются установки типа ОВ-1, состоящие из двух конструктивно самостоятельных частей, допускающих независимое использование, - ОВ-2 и ОВ-3. Установка ОВ-2 осуществляет приготовление общелабораторной воды, превосходящей по качеству очистки дистиллированную воду. Установка ОВ-3 предназначена для получения пригодной для приготовления питательных сред сверхчистой из общелабораторной или дистиллированной воды.

Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды

Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды обеспечивают выполнение всех этапов технологического процесса: предварительную стерилизацию посуды, поступающей из опыта, насыщенным водяным паром в паровых стерилизаторах (автоклавах); предварительное замачивание в водных растворах химических реагентов (5 % растворе ги- похлорита натрия, 3 % растворе перекиси водорода и т. д.); полоскание после замачивания холодной или слегка нагретой водой; мытье горячим раствором детергента с низким пенообразованием; вторичное полоскание горячей водой; финишное полоскание дистиллированной или общелабораторной водой; сушку в сушильных шкафах с принудительной продувкой горячим воздухом; упаковку и финишную стерилизацию в паровых или воздушных стерилизаторах.

Оптимальным вариантом для мытья посуды является использование автоматических моечных машин («Forma Scientific», «Miele», «Hotpack- Heinicke» либо отечественных машин типа P3-AMM).

Требования, предъявляемые к средам

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы.

Многие микроорганизмы нуждаются в так называемых факторах роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термин прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста.

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7, 2—7, 4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне

(рН 8, 5—9, 0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6, 2—6, 8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0, 5% раствору натрия хлорида;

4) быть стерильными, так как контаминанты препятствуют росту изучаемого микроорганизма и изменяют свойства среды (состав, рН и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других — низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы — при RH2 не ниже 10;

7) быть по возможности унифицированными, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк – от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой.

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Исключительное многообразие микроорганизмов делает число таких соединений почти безграничным, так как, с одной стороны, существуют культуры ( гетеротрофы ), способные при осуществлении биосинтеза потреблять углерод только из высокоорганизованных молекул, например белков и пептидов, а с другой – многие ( автотрофы ) бактерии и отчасти дрожжи утилизируют такие простейшие углеродсодержащие соединения, как метан, метанол и даже углекислота.

Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают необходимость в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Все вещества этого ряда находятся в питательных средах в виде солей, исключением являются лишь среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного белка.

Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.

Среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетические субстраты. По способу получения энергии все микроорганизмы делят на две основные группу: хемотрофы и фототрофы.

Монослойные культуры

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату – к другим клеткам либо к стеклу (алюмо-боросиликатное стекло типа пирекс), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и др. при условии правильной обработки этих полимеров) - пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная медицинская нержавеющая сталь или титан. Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо обеспечить поверхностный суммарный заряд субстрата, обеспечивающий прикрепление клеток.

Это может достигаться: 1) за счет электоростатического взаимодействий и 2) за счет присутствия внеклеточного биоматрикса.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Монослойные культуры могут быть применены к любому типу клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость использования.
2. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
3. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
4. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
5. В некоторых случаях, например для пассирования вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Непрерывное культивирование

В отличие от периодического культивирования в непрерывных процессах питательная среда подается непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также осуществляется непрерывно.

По такому принципу организуются 2 разновидности процессов непрерывного культивирования: процессы полного (идеального) смешения, или хемостатные процессы, и процессы полного вытеснения, или тубулярные процессы.

Установившиеся режимы непрерывного культивирования характеризуются постоян-ством концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста популяции.

Непрерывное культивирование проводится в открытой динамической системе, которая может быть как гомогенной, так и гетерогенной. Эта система способна к длительной работе в постоянном установившемся режиме.

Хемостатные процессы непрерывного культивирования
Гомогенные системы идеального смешения

Любой периодический процесс можно перевести в непрерывно-проточный. Непрерывно-проточное культивирование открывает возможности для поддержания постоянных условий роста путем создания такого состава питательной среды, чтобы только один желаемый фактор лимитировал рост. Если в таком процессе плотность популяции определяется химическим составом среды (концентрацией лимитирующего рост фактора), его называют хемостатным культивированием.

Изменяя концентрацию лимитирующего рост фактора, можно изменять плотность популяции, т.е. изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста популяции. При таком методе, регулируя скорость протока, можно воспроизвести любую точку роста периодической культуры.

При таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. В хемостате практически можно только приблизиться к максимальной удельной скорости роста, но не достичь ее, потому что такая скорость роста соответствует критической скорости разбавления, при которой биомасса вымывается из ферментера, что является одним из существенных недостатков хемостата.

Для борьбы с данным явлением возможно использовать комплекс «ферментер-сепаратор». В этом комплексе выходящая из ферментера жидкость сгущается на сепараторе, и часть сгущенного потока непрерывно возвращается в ферментер, остальная часть идет как товарный продукт. Осветленная жидкость сбрасывается в стоки. Основными направлениями использования реципкуляции являются: повышение производительности системы непрерывного культивирования и более полное потребление субстрата из среды.

Одностадийный хемостат применяется при необходимости воспроизвести на протоке любую скорость роста клеток, кроме максимальной.

Двухстадийный хемостат позволяет создавать культуры при скорости роста, близкой к максимальной, и определять условия ее повышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при скорости разбавления, меньшей чем удельная скорость роста, а во второй подается культура из первого.

Особенности двухстадийного хемостата:

1. Вымывания культуры во втором ферментере не происходит из-за непрерывного поступления культуры из первого. Следовательно, концентрация биомассы никогда не сможет стать равной нулю при любой скорости разбавления. Будет возрастать удельная скорость роста клеток и экономический коэффициент.

2. Концентрация субстрата во втором аппарате всегда меньше, чем в первом. Субстрат расходуется из запаса входящего потока. Это имеет значение в тех случаях, когда важен не только выход биомассы, но и ее чистота.

3. Концентрация биомассы во втором аппарате всегда выше, чем в первом (учитывается прирост биомассы).

4. Двухстадийный хемостат часто оказывается удобней для тех процессов, в которых целевым продуктом является не биомасса, а метаболиты.

Турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры. Скорость разбавления сама устанавливается в соответствии с заданной плотностью популяции. Этим турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется скорость разбавления, соответственно которой устанавливается концентрация биомассы.

Хотя теоретически взаимосвязь между концентрацией биомассы и скоростью разбавления подчиняется одним и тем же закономерностям в хемостате и турбидостате, методы управления процессами различны. Турбидостат позволяет получать максимальные скорости роста, которые применяются при культивировании клеточных культур, фиксированных в стадии экспоненциального роста. Хемостаты же применяют при скоростях разбавления от самой низкой до только приближающейся к максимальной удельной скорости роста.

В настоящее время разработаны различные варианты непрерывного культивирования микроорганизмов, работающие по принципу турбидостата – pH-стат, оксистат, СО2-стат, теплостат, респиростат, вискозистат и т. д., названия которых соответствуют задаваемому параметру. Любой параметр, который изменяется в периодической культуре и на который существует датчик, может быть использован для управления ростом по типу турбидостата.

Управляющими параметрами могут быть комплексные параметры, например, содержание кислорода и углекислоты в отходящем воздухе, характеризующие дыхательный коэффициент.

Культуры животных клеток

Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, возникла на базе концепции, принадлежащей К. Бернару.

Чуть позже, в 1885 г., Ру показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он в течение нескольких дней поддерживал в жизнеспособном состоянии нервную пластинку куриного эмбриона в теплом солевом (физиологическом) растворе.

. Инкубация клеток сердца куриного эмбриона была начала 17 января 1913 г. Пересев клеток продолжил Эблинг, работая с ними 34 года. Поскольку Каррель был хирургом, весьма сведущим в вопросах асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток животных in vitro.

В этот же период был разработан очень существенный подход в технике работы с клетками – трипсинизация – для высвобождения клеток из тканевой матрицы. Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 г.

Первые суспензионные культуры клеток животных, полученные в 1953 г. Оуенсом и сотрудниками, основывались на клетках злокачественных тканей. Это – клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток человека и мыши.

До тех пор, пока в 1961 г. Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека ( НDС ) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 генерациями. Перед отмиранием популяции для клеток этой линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений.

Предел, или лимит, Хейфлика – граница количества делений соматических клеток. Эта граница была найдена в культурах всех полностью дифференцированных клеток человека и других животных. Максимальное число делений различно в зависимости от типа клеток и еще сильнее различается в зависимости от организма. Для большинства человеческих клеток предел Хейфлика составляет 52 деления.

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя дальнейшие исследования отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов, идентичных тем, которые найдены в таких известных онкогенных вирусах, как вирус саркомы Рауса и вирус саркомы Молони.

В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и, тем самым, служить средством и объектом во многих исследованиях. Благодаря культивированию клеток возможности исследования и диагностики расширяются почти беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакции на различные агенты, в том числе и на лекарственные воздействия.

Наиболее часто культивируются следующие элементы:

соединительной ткани – фибробласты;

скелетной – кость и хрящи;

мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

⇐ Предыдущая 1 2 3 4 5 6 78