Культуральные системы животных клеток

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 8Следующая ⇒

По характеру и длительности существования культуры животных клеток можно подразделить на первичные и перевиваемые.

Первичной называют клеточную культуру, полученную непосредственно от животного и имеющую ограниченный срок существования. По прошествии определенного времени (20-30 суток) в клетках возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, ошаривании клеток, утрате связи между ними и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение ее состава и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейрогуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток на фоне дегенерации большей части популяции могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Их принято разделять на перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом (клеточные линии), и полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни, выгодно сочетающие черты первичных и перевиваемых клеток.

Первичные культуры после пересева становятся вторичными культурами. В таких культурах также появляются клетки, дающие начало диплоидным и постоянным культурам. Культуры перевиваемых клеток, способные к автономному существованию и бесконечно долгому размножению называются трансформированными.

Другим источником постоянных клеточных линий являются злокачественные новообразования, клетки которых уже трансформированы in vivo при развитии патологического процесса.

Таким образом, различают 3 основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор хромосом, и трансформированные постоянные гетероплоидные культуры, способные к существованию вне организма неограниченно долгое время.

Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани-источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.).

Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшей работы является природа процесса, который будет осуществляться с использованием этих клеток.

Как правило, культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих взрослых тканей. Причиной этого является низкий уровень специализации и наличие в эмбрионах реплицирующихся клеток-предшественников.

Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток. Однако, несмотря на ряд практических преимуществ эмбриональных клеток, необходимо помнить, что эти клетки по ряду параметров отличаются от взрослых клеток. Результаты, полученные при использовании эмбриональных клеток не всегда возможно экстраполировать на взрослый организм.

Получение клеточных линий на основе клеток первичных и диплоидных культур

Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены и четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны выжить в условиях in vitro.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации.

В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм и отмывают от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Дезагрегированные фрагменты прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы.

Ферментативная дезагрегация (0, 01-0, 05 очищенный – 0, 25% неочищенный трипсин, 200-2000 ед/мл неочищенная коллагеназа) дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию. На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается.

Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Они существуют 20-30 суток и дают начало диплоидным культурам. Какое-то время диплоидные клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10-12 месяцев клетки деградируют и погибают. Это наблюдается примерно после 20-50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников первичных клеток – из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). В некоторых случаях отдельные клетки выживают и продолжают размножаться, что приводит к установлению клеточной линии.

Отбор осуществляют при регулярной смене питательной среды, омывающей монослой. Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20-30% объема среды, в течение следующих 3-4 недель – 50-60%, позднее проводят полную замену среды.

По мере смены среды клетки меняют морфологию. Часть клеток ошаривается и отделяется от субстрата. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом удлиняются. Через 7-10 смен, как правило, начинают появляться новые атипичные клеточные элементы, имеющие в разных культурах разную морфологию. Именно они наиболее часто дают начало жизнеспособным линиям перевиваемых клеток.

Таким образом, установление клеточных линий определяется отбором клеток с повышенной активностью из популяций первичных и диплоидных клеток.

Постоянные культуры

У полученных клеточных линий есть 2 пути: После нескольких пересевов линия клеток 1. либо гибнет ( ограниченная линия клеток ), 2. либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. К настоящему времени существует около 500 постоянных клеточных линий, полученных от более чем 40 видов животных

Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается в 1, 5-4 раза – 12 ч вместо 36-48), по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах, по снижению зависимости от субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности и анеуплоидности, а также по увеличению опухолеродности. Однако, нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, не становятся при этом злокачественными (несмотря на некоторые черты сходства).

Таким образом, постоянные клеточные линии имеют определенные преимущества: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности и, следовательно, более высокого выхода биомассы; возможность использования более дешевых сред; способность к суспензионному росту.

Но и недостатки – повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора, утрата специфических маркеров.

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 7 8 Следующая ⇒