Методы создания и биологические свойства синхронных культур микроорганизмов.

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 8Следующая ⇒

Культуры микроорганизмов, даже взятые в один и тот же срок от посева, представляют собой совокупность клеток, находящихся на разных стадиях своего индивидуального развития.

Изучение физиологических свойств и метаболической активности таких культур приводит к получению средних результатов. А модель изолированной живой клетки не может быть использована для изучения ее биологии не только из-за малых количеств биомассы, но и потому, что не отражает свойств клетки, находящейся обычно в условиях популяции.

Стремление получить культуры, все клетки которых в данный момент находятся в одной фазе развития, привело исследователей к разработке метода синхронизации деления микроорганизмов. Этот метод позволяет раздельно и поэтапно изучать физиологические и биохимические процессы, протекающие на разных стадиях развития клетки.

Сущность метода синхронизации заключается в том, что путем различных воздействий микробная популяция искусственно приводится в однородное физиологическое состояние. Наиболее легко определяемым показателем такого состояния популяции является одновременное (синхронное) деление почти всех клеток культуры.

Синхронизации деления подвергались различные объекты: грибы, бактерии, простейшие, водоросли, а также клетки культуры ткани и т. п. Среди бактерий синхронное размножение изучалось главным образом на популяциях Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Corynebacterium diphtheriae и других.

Периодическое синхронное культивирование. Для синхронизации деления обычно применяют популяции в фазе экспоненциального роста, когда клетки наиболее однородны по продолжительности периода генерации.

Степень участия клеток популяции в синхронном делении называют степенью синхронизации. Она выражается значениями индекса синхронизации, который характеризует степень однородности популяции и позволяет сравнить эффективность различных синхронизирующих воздействий. Для определения степени синхронизации наибольшее распространение получил «индекс синхронизации» Шербаума (I_s), вычисляемый по формуле:

Is = (N1/N0 - 1) ■ (1 - T/g),

где N₀ - число клеток непосредственно перед взрывом синхронного деления;

N1 - число клеток после синхронного деления;

Т - время, в течение которого происходит синхронное деление;

g - продолжительность одной генерации.

Способы, вызывающие синхронное деление, весьма разнообразны и многочисленны. В зависимости от характера воздействия их можно разделить на 3 большие группы: 1) механический отбор (селективные методы); 2) действие физических факторов и 3) химико-биологические воздействия.

Методы, основанные на механическом отборе однородных по некоторым признакам клеток из асинхронно делящейся популяции, называются естественными, или селективными. Некоторые из них получили наиболее широкое распространение в микробиологических исследованиях, например фракционное фильтрование и дифференциальное центрифугирование.

К этой же группе методов можно отнести исследования J. Yonng и Ph. Fits-James, получивших синхронное размножение Bacillus cereus за счет развития популяции из отобранных спор.

Таким образом, первая группа методов синхронизации заключается в механическом отборе клеток из популяции в зависимости от их объема, массы или определенной формы существования, как это имеет место в случае отбора спор. Применение селективных методов основано на предположении, что такие свойства, как объем и масса клеток, отражают в известной мере определенное физиологическое состояние. Эти методы имеют то преимущество, что не создают никакого препятствия в обмене веществ у отдельных клеток, как это бывает при использовании других методов.

Вторая группа методов связана с физическими воздействиями, также ведущими популяцию к синхронному размножению. В этом направлении наибольшее распространение получили температурные воздействия. Синхронизация популяций с помощью изменения температуры культивирования достигается однократным (шок) или многократным (сдвиги температуры между двумя уровнями) действием более высокой или более низкой температуры по сравнению с оптимальной для данного вида микроорганизмов. Такое температурное воздействие, блокируя процесс деления, не останавливает роста и развития клеток, что в конечном итоге приводит популяцию в однородное состояние. После снятия шока от 70 до 90 % клеток делится синхронно. Этот вид воздействия в основном применяется для синхронизации бактерий, простейших и клеток культуры ткани.

Одним из методов физического воздействия, применяемых для синхронизации деления, является обработка клеток сублетальными дозами рентгеновских лучей.

К физическому типу воздействий можно отнести также периодическую смену света и темноты, использованную для получения синхронного деления Euglena gracilis и хлореллы. Этот метод считается наиболее естественным, так как основан на цикличности развития водорослей в связи с суточной фотопериодичностью.

Третья группа факторов, вызывающих синхронное размножение, основана на изменениях питательной среды путем введения ингибиторов или лишения среды веществ, необходимых для деления.

Одним из наиболее распространенных методов синхронизации этой группы является так называемый метаболический шок.

Можно получить эффект синхронизации, применяя «голодные» среды, из которых полностью удалены важнейшие компоненты или снижено их содержание. Последующее добавление недостающего вещества или перенесение клеток в полноценную среду вызывает синхронное деление.

Несмотря на разнообразие методов, могущих привести культуру к синхронному размножению, не всегда удается в достаточной степени синхронизировать деление клеток. В таких случаях принято сочетать различные методы.

Непрерывно-синхронное культивирование. Общим и весьма существенным недостатком периодических синхронных культур является быстрая потеря синхронности, наступающая через 2-3 генерации.

Причина подобного явления может заключаться в том, что не все клетки популяции делятся, достигнув одного и того же размера, возраста или момента времени, прошедшего после предыдущего деления. Принято считать, что решающая роль принадлежит фазе развития исходной синхронизируемой культуры. Десинхронизация наступает быстрее при воздействии на культуру синхронизирующим агентом в фазе замедления скорости размножения, т. е. более гетерогенную в отношении продолжительности генерации отдельных клеток.

С середины 60-х гг. XX в. началась разработка методов получения синхронизированных культур на протоке. Такой способ известен как непрерывно-синхронный, или фазовый, метод культивирования, гарантирующий поддержание синхронного деления клеток неограниченно долгое время.

Метод основан на периодическом сливе из ферментера половины объема выросшей культуры через промежутки времени, равные одной генерации, и одновременном добавлении такого же количества свежей питательной среды, что обеспечивает импульсную подачу источников питания. Состав среды подбирается таким образом, чтобы при удвоении биомассы происходило исчерпание питательных веществ, вследствие чего рост культуры должен быть приостановлен. Добавление свежей среды приводит к восстановлению роста, т. е. синхронизация деления достигается голоданием клеток по какому-либо лимитирующему рост субстрату. Лимитирующими факторами могут служить источники азота, углерода, минеральных солей и т. д.

Имеются также данные, свидетельствующие о том, что синхронное деление клеток может быть индуцировано изменением рН, температуры и других условий культивирования, оказывающих воздействие на ряд метаболических процессов клеток.

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 7 8 Следующая ⇒