Получение и культивирование растительных протопластов. Питательные среды и условия. Реверсия растительных протопластов

Способы выделения растительных протопластов

Протопласты растений - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтезы и трансформацию энергии. Термин был использован Д. Ханстеином в 1880 г. для обозначения морфологически обособленных образований при плазмолизе. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 г. Дж. Клеркером.

Наиболее простыми, но длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в 0, 1 М раствор сахарозы, более концентрированный, чем вакуолярный сок, выдерживают определенное время до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов и в этом случае использовать только те ткани, в которых возможен экстенсивный плазмолиз (получить протопласты из меристемы или зрелой ткани очень сложно).

Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов - энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используются ферменты. Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов впервые было успешно осуществлено Е. Кокингом в 1960 г. Он удачно применил ферментный препарат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для получения больших количеств изолированных протопластов из кончиков корней томатов.

В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества: 1) одновременно можно получить большое количество протопластов; 2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки более интакт ны и не повреждены; 4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы - чаще всего грибного или бактериального происхождения. Выбор ферментной системы производится на основании знаний об особенностях растительных тканей. В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.

Источником клеток для получения протопластов помимо фрагментов растительных тканей являются также клеточные суспензии и каллусные культуры.

Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложно получить жизнеспособные протопласты и также непросто их в дальнейшем культивировать. Успех процесса зависит от многих факторов - состава ферментов, их качества, рН среды, выбора осмотического раствора. Большое значение при этом имеет состояние растительного материала, а именно, его видовая, генетическая, энергетическая и физиологическая характеристики, а также применяемые методы получения и культивирования протопластов.

Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания.

Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

Культивирование растительных протопластов

Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель (К. Као и др., 1971). В этом случае суспензия протопластов в виде капель в жидкой среде помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме того, легко можно добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует дальнейшему успешному культивированию. Этот метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.

Другой широко распространенный метод - агаровая культура (T. Нагата, И. Такебе, 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45^о С. Чашки заклеивают парафиллюмом и культивируют при температуре около 28^о С. Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно наблюдать для одного конкретного протопласта все этапы его развития - формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.

Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения (доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток). Они смешиваются с жизнеспособными протопластами и платируются. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.

Сходным с этим методом является метод совместных культур. Он используется для эффективного культивирования труднокультивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех такого культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.

Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около 1000 клеток/мл.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Наиболее часто используют среды Мурасиге - Скуга, модифицированную среду Нагата - Такебе, среду В 5 Гамборга - Эве- лейта, и среду 8Р Као - Мичайлук, представляющую собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В5 Гамборга. Все эти среды содержат минеральные вещества, являющиеся источниками макро- и микроэлементов, источники углерода, стабилизаторы осмотического давления, витамины, фитогормоны.

Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах - создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода.

Рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки, а также ксилозу, рибозу и другие. Это стимулирует образование клеточной стенки. Состав этих добавок может быть очень специфичным в зависимости от видовых особенностей протопластов. Для индукции деления протопластов многих видов растений эффективно добавлять в среду ауксины - 2, 4-Д, НУК, БАП, а также цитокинины - кинетин, зеатин, бензиладенин.

Температура культивирования является в значительной степени видоспецифичной и варьирует в достаточно широких пределах. При культивировании растительных протопластов температурный режим должен строго выдерживаться, т. к. обычно протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. То же касается и интенсивности освещенности. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света.

Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой плотности возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет 10 -10 кл/мл.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно успешное осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь в отдельных случаях получения целого растения из единичных протопластов.

Детальная разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 Следующая ⇒