Характерные особенности качественной и количественной оценки основных параметров роста клеточной культуры.

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 8Следующая ⇒

Под урожаем клеток (Х) понимают разность между максимальной и исходной массой бактерий: X = Xmax - Х0. Эту величину выражают в весовых единицах, чаще в граммах. Особенно важно отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата (X/S). Если обе эти величины выражают в весовых единицах, то отношение Х/S, называемое экономическим коэффициентом, обозначают через Y: Y = dX/dS, где dX - увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве dS. Более строго эконом. Коэфф. определяется пределом, к кот. стремится данное соотношение при dS, стремящейся к нулю. Важность эконом. Коэфф. состоит в том, что он выражает количественные потребности организма в пище. Если же урожай (в граммах) относят к числу молей потребленного субстрата, то эконом. Коэфф., называемый в этом случае молярным экономическим коэффициентом, обозначают через Ym. Молярный экономический коэффициент Ym позволяет связать урожай клеток с полученным из какого-либо источника энергии (т. е. какого-либо субстрата) количеством АТФ (макроэргические эквиваленты). Ya^ - энергетический коэффициент, выражаемый в граммах клеточной массы на 1 моль АТФ. Этот коэффициент можно вычислить, если известен путь расщепления данного субстрата и выход АТФ в результате этого расщепления.Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени выражается соотношением: dS/dT = qX, где X - биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент, или удельная скорость метаболизма. Метабол. коэфф. аналогичен ферментативной активности. Мет.коэф. можно выразить также через эконом.коэы. и уд. скорость роста и представить еще в таком виде: q = ц/Y.Если удовлетворены все необходимые требования, то предполагается, что в течение единицы времени dt увеличение биомассы dX должно быть пропорционально количеству биомассы X и интервалу времени, т. е.: dX = yXdt, откудаdX/dt = цХ или ц = dX/dt • 1/X.

Дифференциальное отношение dX/dt выражает скорость роста популяции клеток. Параметр ц, обозначающий скорость роста единицы биомассы (I/X) (dX/dt), называется удельной скоростью роста и измеряется в единицах, обратных времени (1/t). Этот параметр аналогичен сложным процентам. Так, например, удельная скорость роста 0, 1 ч эквивалентна скорости 10 % в 1 час. Рост популяции клеток, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциальным, или логарифмическим, ростом. Для того чтобы рассчитать время генерации клеток, можно использовать уравнение, учитывая геометрическую прогрессию роста:

N = N0 • 2n, откуда lgN = lgN0 + n lg2, где N - число клеток.

Отсюда число клеточных делений (n) составит:

n = lgN-lgN0 /lg2.

Основные особенности культивирования клеток беспозвоночных животных.

В настоящее время известно около 150 перевиваемых линий клеток беспозвоночных, наибольшее число из которых получено от насекомых.

Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьируют по составу. При составлении питательных сред часто руководствуются данными по составу гемолимфы, различающейся у разных видов насекомых. В настоящее время предложено более 50 вариантов питательных сред для культивирования клеток беспозвоночных. Все эти среды отличаются от сред для клеток млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением. Ни одна из этих сред не пригодна для получения культур клеток всех видов беспозвоночных, т. е. не является универсальной.

Для получения культур клеток насекомых часто берут эмбриональные клетки. Первичные культуры служат источником для получения длительно пересеваемых линий клеток беспозвоночных. С помощью методов первичного культивирования клеток удается исследовать диффе- ренцировку и метаболизм клеток беспозвоночных в культуре.

После длительного периода адаптации клеток к условиям культивирования удается проводить пересев клеток. Обычно период адаптации занимает 3-10 месяцев от момента эксплантации клеток в первичную культуру. В настоящее время получен целый ряд пересеваемых линий клеток из различных тканей, взятых на разных стадиях развития беспозвоночных животных.

Культуры клеток беспозвоночных животных представляют огромный интерес для изучения молекулярных механизмов взаимодействия хозяин - паразит, роли мобильных генетических элементов в адаптации беспозвоночных к стрессовым ситуациям окружающей среды, регуляции действия генов в клетках высших организмов и клеточных механизмов дифференцировки и т. д.

Возможности культивирования клеток разных типов в известных культуральных системах.

Особенности поверхностного способа культивирования клеток животных и микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов
на твердой поверхности
Культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ:
1. В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать оборудование для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии.
2. Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов.
3. На твердых средах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем.

Поверхностные жидкофазные процессы в биотехнологических производствах используют для культивирования мицелиальных грибов при получении органических кислот, ферментных препаратов, кормовой биомассы. Для этих целей применяется кюветный способ культивирования. Среда загружается в стерильные кюветы, размещаемые на открытых стеллажах в растильных камерах с регулируемым температурно-влажностным режимом. Вентиляцию помещений осуществляют очищенным стерильным воздухом, который одновременно выполняет функцию теплового агента.
Микроорганизмы растут в виде пленки биомассы на поверхности жидкой питательной среды.
После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцеры и поступает на обработку.

Монослойные культуры

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату – к другим клеткам либо к стеклу (алюмо-боросиликатное стекло типа пирекс), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и др. при условии правильной обработки этих полимеров) - пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная медицинская нержавеющая сталь или титан. Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо обеспечить поверхностный суммарный заряд субстрата, обеспечивающий прикрепление клеток.

Это может достигаться: 1) за счет электоростатического взаимодействий и 2) за счет присутствия внеклеточного биоматрикса.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:
1. Монослойные культуры могут быть применены к любому типу клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость использования.
2. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
3. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
4. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
5. В некоторых случаях, например для пассирования вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 8 Следующая ⇒