|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ. Часть II Частная микробиологияСтр 1 из 20Следующая ⇒
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ Часть II Частная микробиология Методические указания к лабораторным занятиям для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария уровень высшего образования специалитет квалификация: специалист форма обучения: очная Троицк 2017
УДК 619:579(07) ББК 48.41я73 Утверждено на заседании Методической комиссии факультета ветеринарной медицины протокол № 8а от 23.03.2017 г.
Рецензент: Е. П. Циулина, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры незаразных болезней
Епанчинцева, О. В. Ветеринарная микробиология и микология. Часть II. Частная микробиология: методические указания к лабораторным занятиям для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария, уровень высшего образования специалитет, квалификация: специалист, форма обучения очная /О. В. Епанчинцева. – Троицк : ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГАУ, 2017. – 85 с.
В методических указаниях представлены тематика, содержание лабораторных занятий по разделу «Частная микробиология» дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология», включая цель, план занятия, теоретический материал, практические задания, вопросы и задания для контроля знаний, рекомендуемую литературу. Методические указания предназначены для обучающихся по специальности 36.05.01. Ветеринария уровень высшего образования специалитет. УДК 619:579(07) ББК 48.41я73
© ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГАУ © О.В. Епанчинцева
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение Методические указания составлены в соответствии с рабочей программой, тематическим планом дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология», с требованиями ФГОС ВО по специальности 36.05.01 Ветеринария, уровень высшего образования специалитет, утвержденного МОиН РФ 03.09. 2015 г. № 962 и предназначены для самостоятельной работы обучающихся факультета ветеринарной медицины на лабораторных занятиях по указанной дисциплине. Специалист по специальности 36.05.01 Ветеринария должен быть подготовлен к врачебной, экспертно-контрольной и научно-исследовательской деятельности. Целью дисциплины является освоение обучающимися в соответствии с формируемыми компетенциями теоретических и практических знаний о многообразии биологических объектов, изучаемых по общей и частной ветеринарной микробиологии и микологии, приобретении умений и навыков в области приемов и методов диагностики инфекционных болезней животных, конструирования рекомбинантных бактерий вакцинных штаммов и продуцентов биологически активных веществ, создания новых видов диагностикумов, вакцин и сывороток. Задачи дисциплины. Изучение: - объектов ветеринарной микробиологии, их морфологии, физиологии, экологии, эволюции. - возбудителей инфекционных болезней животных. - методов современной микробиологии, ее возможностей, достижений и перспектив развития. - основ санитарной микробиологии. - основ инфекционного процесса и факторов патогенности микроорганизмов. - основ иммунологии и факторов иммунного ответа организма животных на возбудителей инфекционных болезней. - перспективных и экологически безопасных технологических процессов, основанных на использовании микроорганизмов. Овладение практическими навыками: - проведения классических и генотипических методов лабораторной диагностики инфекционных болезней животных. - изучения строения бактерий и микроскопических грибов, генетики микроорганизмов, тинкториальных, культуральных, биохимических, патогенных свойств, антигенной структуры. - изготовления диагностикумов и перспективных путей совершенствования технологии их производства с использованием достижений молекулярной биологии, иммунологии, генной и клеточной инженерии. Методические указания включают тематику, цель, план, материальное обеспечение, теоретический материал лабораторных занятий раздела «Частная микробиология», практические задания, вопросы для контроля знаний, список литературы и источников, приложение. При выполнении практических заданий на лабораторных занятиях студенты, руководствуясь методическими указаниями, изучают теоретический материал, проводят необходимые исследования, делают зарисовки, схемы. Проводят учет и оценку полученных результатов с последующим обсуждением и подведением итогов занятия, отчитываются преподавателю. Материал, изложенный в учебно-методическом издании, позволит обучающимся не только теоретически, но и практически освоить методики проведения, учета и оценки серологических реакций, понять сущность бактериологических и иммунологических методов, их практическую значимость в диагностике инфекционных болезней животных. Рекомендуемая литература имеется в библиотеке института ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Южно-Уральского ГАУ. Содержание лабораторных занятий План 1. Взятие и пересылка патологического материала. 2. Сопроводительная документация. Материальное обеспечение: образцы патологического материала (паренхиматозные органы, лимфатические узлы, трубчатая кость, кровь, сыворотка крови, содержимое абсцессов), стерильная посуда, пакеты, инструменты для отбора проб, нормативная документация, пробирки со стерильным физ. раствором, консервирующие средства, спиртовки, Ветеринарное Законодательство том II, 1972 года издания. Теоретический материал Правила взятия патологического материала, крови, кормов и пересылки их для лабораторного исследования изложены в Ветеринарном Законодательстве том II, 1972 года издания на странице 155. Во всех случаях взятия и пересылки материала специалист обязан руководствоваться изложенными ниже правилами, а также соответствующими инструкциями по борьбе с болезнями животных. Взятие и пересылка патологического материала для бактериологического и вирусологического исследований Патологический материал необходимо брать стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого берут патологический материал, на месте разреза следует обжечь над пламенем или прижечь нагретой металлической пластинкой. Патологический материал должен быть взят как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года, т.к. сразу же после заболевания (или впервые же 1-2 дня) барьерная роль кишечника значительно ослабевает, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссиминации кишечной флоры. Кроме того, по мере углубления инфекционного процесса количество вируса может снижаться в результате одновременного воздействия защитных сил организма. Следует учитывать, что при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется очень незначительным. Вторая причина необходимости экстренного взятия материала – избежать посмертных изменений в тканях, иначе они могут оказаться непригодными для бактериологических и вирусологических исследований. Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни: · от больных с выраженной клиникой с указанием температуры, частоты пульса и дыхания (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы); · от убитых в агонии (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы); · от выздоравливающих животных (кровь). Взятые пробы следует как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов разложения материала. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Если патологический материал невозможно доставить в лабораторию в течение ближайших 24-30 часов, его посылают только в консервированном виде. Патологический материал (органы или их части) консервируют 30-50%-ным раствором химически чистого глицерина на физиологическом растворе. Физиологический раствор предварительно стерилизуют при 1200С в течение 30 мин. Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве 4-5 раз, превышающем его объем. Консервированные образцы желательно хранить в холодильнике. Небольшие трупы (поросят, мелких животных можно посылать целиком во влагонепроницаемой таре). Трубчатые кости посылают на исследование в целом виде, очищенными от мышц и сухожилий. Кости завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью и пересылают в сейф - пакетах или в стерильных полиэтиленовых пакетах. Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от фекальных масс, а концы кишечника перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями. Кишечник помещают в банки с 30%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором поваренной соли. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 4-5 раз. Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках, банках, которые закрывают пергаментной бумагой, пробками или в контейнерах. Кал от трупов животных можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов, он должен быть доставлен в лабораторию не позднее 24 ч после его взятия. Для исследования участков кожи берут наиболее пораженные ее кусочки размером 10x10 см и посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде. При взятии содержимого гигром (бурс) в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70°-ным спиртом и обрабатывают 5%-ной настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой. Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Из каждой доли вымени берут последние порции молока по 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками. У овец и коз пробы молока берут с помощью молочного катетера или путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом или смазывают 5%-ной настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска. После попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой. Пробы мочи берут катетером в стерильную посуду. При его отсутствии мочу получают при естественном мочеиспускании или, вызывая последнее, раздражением наружных половых органов. Пробы слизи из половых органов животных берут стерильным марлевым тампонам при помощи специальных инструментов конструкции Павловского, Жавордова, Казеева, а также применяемых при искусственном осеменении коров шприца-катетера или полистироловой пипетки, соединенной со шприцем. Для получения смывов слизистой оболочки носовой полости, половых органов, конъюнктивы и др. полость орошают стерильным физиологическим раствором или солевым раствором Хенкса (см. приложение) и собирают стекающий раствор в емкости. Иногда для получения смывов в полость вводят стерильный ватный тампон, смоченный физиологическим или солевым сбалансированным раствором. Тампоном тщательно протирают слизистую, извлекают его и помещают во флаконы с аналогичным раствором. Мазки из носа, полости рта, прямой кишки, клоаки у птиц и т.д. берут при помощи стерильных ватных тампонов на довольно длинных стерильных деревянных палочках. После взятия мазка тампон помещают в пробирку, заполненную соответствующей жидкостью. Наиболее часто для этого используют реактив Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, нистатин) и белковым стабилизатором, например с 0,5% желатина или 0,5-1% альбумина бычьей сыворотки. Упаковка и пересылка патологического материала Трупы мелких животных, части трупов животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным. Посылаемый материал должен быть тщательно упакован, чтобы предупредить возможность рассеивания инфекции в пути. Упаковка должна быть трехслойной: 1) емкость, содержащая пробу, должна быть водонепроницаемой, а в случае использования подвижных буферных растворов - герметичной; 2) внутренняя упаковка должна быть водонепроницаемой с достаточным количеством поглощающего материала на случай утечки для впитывания всей жидкости, содержащейся в пробе (вата, бумага); 3) наружная упаковка предназначена для защиты внутренней от физических повреждений и воды (герметичный термоконтейнер). При перевозке наиболее надежным способом консервирования вируссодержащих проб является их замораживание. При транспортировке проб на дальние расстояния следует использовать сухой лед. В качестве емкости для материала и льда используют пластмассовые контейнеры, легкие по массе, с хорошей теплоизоляцией, небьющиеся и прочные. Следует избегать колебаний температуры, особенно резких ее перепадов, а также повторных замораживаний и оттаиваний. Температура является определяющим фактором, влияющим на выживаемость вируса во время перевозки. Титр вируса снижается очень быстро, если температура среды, в которой его транспортируют, поднимается выше 200С; у большинства вирусов это снижение происходит настолько быстро, что превращает последующее выделение вируса в пустую трату времени. Если замораживание невозможно, то следует использовать один из следующих консервирующих растворов. Кроме правильно выбранного материала, взятого в подходящие сроки и пересланного с соблюдением необходимых условий, лаборатория нуждается в определенной информации, касающейся больного и диагностических проб. Вместе с пробами направлять подробное описание динамики заболевания животного (время появления, быстрота охвата, процент заболеваемости, наличие летальных исходов или тяжелых осложнений, период переболевания, клиническая картина, протокол вскрытия, чем лечили, прививали). На взятый материал составляют сопроводительный документ. В Ветеринарном Законодательстве том II, 1972 года издания на страницах 178-180 представлены три формы сопроводительных документов – к патологическому материалу, к пробам крови, к пробам кожевенного сырья. Если при вскрытии посылки в лаборатории обнаруживается несоответствие сопроводительному документу или порча патологического материала, то обязательно составляют акт, копию которого отправляют ветеринарному врачу, направлявшему материал в лабораторию. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Освоить правила отбора проб патологического материала от животных для бактериологического исследования. Этапы выполнения задания: 1 Определить и отобрать участок пораженных тканей, органов. 2 Подготовить пробы паренхиматозных органов, трубчатую кость для транспортировки в лабораторию. 3 Выбрать необходимый консервант и консервировать сыворотки крови животных для серологического исследования. Практическое задание 2. Составить сопроводительный документ на патологический материал, используя Ветеринарное Законодательство. 1 Составить сопроводительный документ на пробы патологического материала от животных для бактериологического исследования при подозрении на кишечные инфекции. 2 Составить сопроводительный документ на пробы сыворотки крови для серологического исследования на бруцеллёз. 3 Составить сопроводительный документ на пробы кожевенного сырья для серологического исследования на сибирскую язву. 4 Отчитаться преподавателю о выполненной работе. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Определите порядок и цель отбора проб патологического материала от животных. 2 Какие правила необходимо соблюдать при отборе, транспортировке и хранении проб патологического материала? 3 Какую информацию необходимо указать в сопроводительном документе на пробы материалов для микробиологического исследования? 4 Чем консервируют патологический материал, предназначенный для бактериологического исследования? 5 Чем консервируют патологический материал, предназначенный для вирусологического исследования? 6 Назовите способы консервирования патологического материала, обоснуйте их применение. 7 Поясните порядок составления сопроводительных документов на патологический материал. 8 Для чего необходимо указывать в сопроводительном документе к пробам крови дату вакцинации животных? 9 Какой патологический материал берут от трупов павших животных? План 1. Общие сведения о серологических реакциях. 2. Реакция агглютинации (РА) и ее разновидности. 3. Реакция преципитации (РП), методы постановки. Материальное обеспечение: свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных, антигены для РА (стандартные антигены, выпускаемые биофабриками), диагностические специфические сыворотки, штатив с пробирками Флоринского, мерные пипетки, физ. раствор, Сыворотка крови, кусочки паренхиматозных органов, кожи (5х5см) в сухом или загнившем состоянии, не обработанные дезинфицирующими средствами. Шерсть, волос, щетина (не менее 20-30 грамм). Пробирки с экстрагированным антигеном, с преципитирующей сывороткой гомологичной антигену, с нормальной сывороткой, чистые преципитационные пробирки (Уленгута), тонкие пастеровские пипетки, резиновые груши, агар в колбах и водяная баня для расплавления агара, предметные стёкла, стерильные чашки Петри, эксикаторы, пробойник для создания углублений в агаре, таблицы по теме занятия (Реакция агглютинации, Реакция преципитации). Теоретический материал Серологическими называют реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела. В основе всех серологических реакций лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном, в результате чего образуется комплекс антиген+антитело. Антигены (АГ) – это генетически чужеродные для организма вещества и клетки, способные вызывать образование антител и другие формы иммунного ответа. К антигенам относятся также микробы и их токсины. В качестве антигена в серологических реакциях обычно участвуют как целые микробные клетки живые или убитые, так и отдельные их компоненты, продукты распада и токсины. В связи с этим различают антигены корпускулярные (частичковые) и растворимые, представляющие собой продукты распада, экстракты из разрушенных бактерий, токсины. В составе микробной клетки содержатся разные антигены: капсульные (К-антиген), жгутиковые (Н-антиген), соматические (О-антиген) и др. Особенности антигенной структуры различных видов и вариантов микроорганизмов лежат в основе их серологической идентификации (серотипизации), а также учитываются при конструировании вакцин. Антитела (АТ) – это особый вид белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые вырабатываются в организме под влиянием антигенов и способные специфически реагировать с ними. Антитела накапливаются, в основном, в крови, содержатся в секретах слизистых оболочек, молоке, моче и других жидкостях организма, обеспечивая гуморальный иммунитет (humor (лат.) – жидкость). Обнаружение специфических антител к определённому микробу – возбудителю свидетельствует о болезни, бактерионосительстве, или же характеризует состояние активного или пассивного иммунитета после вакцинации, введения иммунной сыворотки, передачи антител с молозивом или через желток яйца. Серологические реакции используются в диагностических целях в двух основных направлениях: Выявление больных животных или бактерионосителей путём обнаружения у них антител. В этом случае к исследуемой сыворотке (или другому материалу) добавляется стандартный, то есть известный антиген. Обычно это взвесь убитых микробов определённого вида или типа. Определение вида или типа микробов, то есть серологическая идентификация. Для этого выделенную культуру микробов смешивают с известной (диагностической) сывороткой, содержащей антитела к определённому виду или типу возбудителя. Серологические реакции применяют также для контроля напряжённости иммунитета (титров антител) после вакцинации или пассивной иммунизации. Реакция между антигеном и антителом может проявляться по-разному (феномен реакции). Различают реакции осадочные, лизирующие и нейтрализующие. Осадочные: реакция агглютинации, в которой происходит склеивание корпускулярного антигена соответствующими антителами агглютинами; реакция преципитации или осаждения растворимого антигена антителами преципитинами. В реакциях лизиса участвуют антитела лизины, вызывающие растворение соответствующего корпускулярного антигена (бактериолизины, гемолизины и др.). В реакции нейтрализации происходит обезвреживание (нейтрализация) токсического действия антигена (токсина) нейтрализующими антителами.
Общие закономерности серологических реакций: реакции ставятся in vitro (в пробирках, лунках планшет, на стекле, в агаровом геле в чашках Петри и др.); проявляются при соответствии (гомологичности) антигена и антитела; протекают в две фазы: а) специфическая – взаимодействие антигена с антителом; б) неспецифическая – образование видимого комплекса антиген-антитело (иногда для этого в реакцию вводят дополнительные системы). Для определения родовой, видовой или типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путём многократного введения животным в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После накопления в крови достаточного количества антител проводят кровопускание и получают сыворотку, которую консервируют, проверяют на активность (титр антител) и стерильность, разливают в ампулы. Реакция агглютинации (РА) – одна из первых серологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые реакцию применил Ф. Видаль (1895) для диагностики брюшного тифа. Позже (1897) эту реакцию для диагностики бруцеллёза у людей использовал А. Райт. В ветеринарной практике данную реакцию применяют для диагностики бруцеллёза, сальмонеллёзов, лептоспироза, листериоза, кампилобактериоза, микоплазмоза и пуллороза птиц, типизации возбудителя колибактериоза, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомо известной агглютинирующей сыворотке. Сущность реакции. Реакция агглютинации (agglutination – склеивание) проявляется в склеивании микробов (клеток) при действии на них специфических антител с образованием комочков, хлопьев и последующим выпадением их в осадок (агглютинат). Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки. Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16-24 часов. Если антигеном служит взвесь подвижных бактерий (Н-антиген), формируется крупнохлопчатый рыхлый осадок в более короткий срок. Методы постановки РА: классический (пробирочный), капельный (пластинчатый), кровекапельная реакция агглютинации (ККРА), розбенгалпроба (РБП), кольцевая реакция с молоком (КР), реакция микроагглютинации (РМА), реакция гемагглютинации (РГА) и её разновидности. Материал исследований. Для определения антител (по известному антигену) используют свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных. Антиген для РА представляет собой взвесь убитых или живых бактерий в физиологическом растворе. Обычно используют стандартные антигены, выпускаемые биофабриками. Если же требуется идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из биоматериала, применяют стандартные диагностические сыворотки, а антиген готовят из суточной микробной культуры – смыв с агаровой среды. Классический (пробирочный) метод В зависимости от вида диагностируемого заболевания готовят соответствующие разведения сывороток (согласно инструкции). Это объясняется различным содержанием в сыворотке разных видов животных нормальных антител, которые будут искажать результаты реакции. Например, для диагностики бруцеллёза крупного рогатого скота сыворотки разводят 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Вначале готовят исходное (основное) разведение 1:25,смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки наливают по 1 мл физиологического раствора. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки переносят 1 мл в первую опытную пробирку и смешивают с физиологическим раствором (разведение становится 1:50). Далее, 1мл переносят во вторую пробирку (1:100), из второй – в третью 1мл и т.д. Из последней пробирки 1мл смеси удаляют (для выравнивания объёма). Во все пробирки с разведениями сыворотки, кроме основного, добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием, выдерживают в термостате 4-6 ч при 37ºС, а затем при комнатной температуре 14-16 ч, после чего учитывают результат. При постановке РА обязательны контроли: отрицательный – в тех же разведениях исследуют нормальную (отрицательную) сыворотку (от заведомо здорового животного) с тем же антигеном; положительный – в тех же разведениях исследуют позитивную сыворотку (положительную) – от заведомо больного животного или стандартную (биофабричного производства) с тем же антигеном; контроль антигена – с целью исключения самоагглютинации в1мл физиологического раствора (без сыворотки) добавляют 2 капли антигена; контроль качества испытуемой сыворотки – пробирка с основным разведением испытуемой сыворотки. Учёт и оценка реакции. Проводят визуально в каждой пробирке, начиная с контрольных. Результаты РА выражают в крестах (плюсах) в зависимости от степени выраженности осадка и просветления жидкости: ++++ (#) – полное просветление жидкости, на дне пробирки осадок из склеенных микробных клеток в виде перевёрнутого зонтика. При лёгком встряхивании осадок разбивается на хлопья, комочки. При этом жидкость остаётся прозрачной. (100% агглютинация); +++ – неполное просветление жидкости (опалесценция) и хорошо выраженный «зонтик». (75% агглютинация); ++ – слабое просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен. (50% агглютинация); + – едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании обнаруживают небольшое количество хлопьев, комочков. (25% агглютинация); - – просветление жидкости и «зонтик» отсутствуют. Может наблюдаться небольшой осадок в виде точки из осевших несклеенных микробов, который при встряхивании разбивается в равномерную взвесь. При большинстве болезней оценку агглютинации на два, три и четыре креста признают положительной реакцией. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается данная реакция, считается её титром. Диагностическую оценку реакции проводят с учётом выраженности в крестах и по высоте её титров. Капельный (пластинчатый) метод РА применяют для: 1) ориентировочной типизации (идентификации) вида микроба. На предметное стекло наносят каплю известной специфической сыворотки и отдельно каплю физиологического раствора (контроль). Бактериологической петлей в каждую каплю вносят испытуемую микробную культуру (исследуемый материал) и равномерно размешивают. 2) массовой диагностики хронических инфекционных болезней животных (например, бруцеллеза). В этом случае исследуемым материалом служит сыворотка крови животных. В отрицательном контроле используют сыворотку крови здоровых животных, в положительном – специфическую биофабричную сыворотку. Во все капли сывороток добавляют специфический антиген. Сыворотки крови животных, давшие положительную реакцию, далее исследуют классическим методом РА с целью определения титра антител. Учет реакции проводят в течение двух минут, визуально. Положительная реакция – жидкость в капле просветляется, хорошо заметна агглютинация в виде комочков сероватого цвета. Положительная реакция свидетельствует о гомологичности антигена и антитела. Отрицательная реакция – жидкость остается равномерно мутной, без комочков (агглютинация отсутствует). В контроле должна быть отрицательная реакция. Роз-бенгал проба (РБП). Реакция применяется при исследовании сывороток крови при диагностике бруцеллёза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, верблюдов, маралов, северных оленей. Роз-бенгал проба характеризуется быстротой и простотой выполнения, высокой специфичностью. Материалы и оборудование. Исследуемая сыворотка крови, стекла или эмалированные диагностические пластины с лунками, микропипетки, антиген бруцеллёзный цветной для роз-бенгал пробы – суспензия бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет, позитивная сыворотка, негативная сыворотка. Сущность РБП заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антитела к определенному (известному) антигену, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование хлопьев и просветление жидкости. Порядок постановки реакции. РБП проводят при температуре 18-3 0°С на чистом стекле или сухой эмалированной диагностической пластине с лунками. Цельную (не разведенную) исследуемую сыворотку крови в дозе 0,03см³ микропипеткой вносят на край дна лунки. При исследовании крови крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 см³ антигена, а при исследовании сыворотки крови овец, коз, свиней и северных оленей – 0,015 см³ антигена. Затем антиген смешивают с сывороткой осторожным вращательным движением. Контроль: 1) положительный – антиген + позитивная сыворотка; 2) отрицательный – антиген + негативная сыворотка; 3) контроль антигена на спонтанную агглютинацию – антиген + физиологический раствор. Оценка результатов. Роз-бенгал пробу считают положительной при наличии выраженной агглютинации антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, наступающей в течение четырех минут. Реакцию агглютинации, появляющуюся позже четырех минут, не учитывают. Все сыворотки, с которыми получена положительная РБП, в тот же, или на другой день исследуют в РА и РСК для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Реакция преципитации (РП). Преципитация (от латинского слова praecipitatio – сбрасывание, падение вниз) – это реакция осаждения из коллоидного раствора комплекса антигена (преципиногена) под влиянием антител (преципитинов) иммунной сыворотки. Итальянский учёный А. Асколи в 1910 году предложил метод постановки реакции, при котором раствор антигенов и антител наслаивается в пробирке без смешивания; при этом между фазами возникает серовато-белый диск осадка – «кольцо». Отсюда название – реакция кольцепреципитации. В 1946 году Оудин предложил метод простой диффузии в агаровый гель. В 1948 году Оухтерлони предложил метод двойной диффузии в агаровый гель (в чашках или на пластинках). В 1959 году Вязов – метод двойной диффузии в агаровый гель в капиллярах. В 1953 году Экли и Фултрон – метод двойной диффузии в агаровый гель в пробирках. Сущность реакции и цель применения. РП – это реакция коллоидного типа. При соединении соответствующих преципитинов (АТ) и преципитиногенов (АГ) происходит образование комплекса антиген-антитело и выпадение осадка (преципитат). РП отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет не только выявлять малые количества белкового антигена (1:1 000 000), но и устанавливать его принадлежность. РП – один из наиболее простых иммунологических методов исследования. В ветеринарной практике её используют для диагностики ряда инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы. В ветеринарно-санитарной экспертизе – при выявлении фальсификации мясных, рыбных и растительных изделий. В судебной медицине и ветеринарии – для установления видовой принадлежности белка крови и т. д. РП применяют с диагностической целью для обнаружения антител в сыворотке крови обследуемого животного, а также с целью идентификации выделенных от животных микроорганизмов и тканевых антигенов. Материал исследований. Сыворотка крови, кусочки паренхиматозных органов, кожи (5х5см) в сухом или загнившем состоянии, не обработанные дезинфицирующими средствами. Шерсть, волос, щетина (не менее 20-30 грамм). Мясо, рыба, молоко, растительные продукты. Компоненты реакции. Пробирки с экстрагированным антигеном, с преципитирующей сывороткой гомологичной антигену, с нормальной сывороткой, чистые преципитационные пробирки (Уленгута), тонкие пастеровские пипетки, резиновые груши, агар в колбах и водяная баня для расплавления агара, предметные стёкла, стерильные чашки Петри, эксикаторы, пробойник для создания углублений в агаре. Подготовка материала к исследованию. Антигены (преципитиногены) представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы; экстракты из микроорганизмов, органов и тканей; продукты распада бактериальных клеток, их лизаты; фильтраты патологического материала. Преципиногены резистентны к нагреванию (кипячению, автоклавированию) и гниению. Существуют физические и химические методы получения антигенов. Физические методы: а) Механические. Густую массу отмытых физиологическим раствором бактериальных клеток растирают в стерильной ступке с песком или стеклянным порошком, затем наливают небольшое количество нейтрального физиологического раствора, центрифугируют (или фильтруют) до получения прозрачной жидкости, которую используют как антиген. б) Замораживание и оттаивание взвеси бактерий. Это приводит к разрушению клеточной стенки и выходу протоплазмы в раствор. После центрифугирования надосадочную жидкость (антиген) используют в работе. в) Метод звуковых колебаний. Применяют специальные аппараты с особым зуммером. Прибор погружают внутрь жидкости с взвесью бактерий и включают. Клетки разрушаются (как при действии ультразвука). г) Кипячение. Бактериальную взвесь (или измельчённую ткань) в физиологическом растворе кипятят 1-2 часа, фильтруют через асбестовую вату. Химические методы: Для разрушения бактерий в условиях производства биопрепаратов, а также в научных целях используют аутолиз бактериальных клеток, их разрушение ферментами, высушиванием в ацетоне и др. Преципитирующие сыворотки получают путём гипериммунизации кроликов, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки. Титр преципитирующей сыворотки определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется данной сывороткой. Это объясняется тем, что преципитиноген, участвующий в РП, содержит в единице объёма гораздо больше частиц, чем антител в преципитирующей сыворотке такого же объёма. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100 000. Порядок постановки реакции. Метод смешивания антигена с сывороткой. Берут 10 преципитационных пробирок, в 9 из них наливают по 0,2 мл цельной (либо разведенной 1:2) преципитирующей сыворотки. Отдельно готовят десятикратные разведения в физиологическом растворе исследуемого антигена от 1:10 до 1:10 000 000. По 0,2 мл каждого разведения добавляют в семь пробирок с иммунной сывороткой. В восьмую пробирку (контроль преципитирующей сыворотки) добавляют 0,2 мл физиологического раствора, а в девятую – 0,2 мл гетерологичного антигена или стерильной среды (контроль специфической сыворотки). В десятую пробирку наливают 0,2 мл нормальной сыворотки и 0,2 мл разведенного в 10 раз антигена (отрицательный контроль). Все пробирки встряхивают до полного смешивания жидкости и помещают в термостат при температуре 37°С на два часа, затем выдерживают в рефрижераторе при 0-5°С (или при комнатной температуре) 18 -20 часов. Учет реакции. При положительной реакции на дно пробирок выпадают хлопья преципитата. Метод кольцепреципитации В узкие пробирки Уленгута (диаметр 0,4-0,5см), держа в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке разливают одинаковое количество (по 0,3-0,4 мл) специфической преципитирующей сыворотки и антигена. Технику постановки реакции осуществляют либо наслаиванием антигена на сыворотку, либо подслаиванием сыворотки под антиген (чтобы не произошло смешивания, так как сыворотка тяжелее антигена). Специфичность реакции проверяют контролями сыворотки и антигена. Контроль сыворотки. На иммунную сыворотку в отдельных пробирках наслаивают: в одну пробирку 0,1 мл физиологического раствора, в другую – 0,1 мл стерильной среды, на которой готовился антиген, в третью пробирку –0,1 мл гетерогенного антигена. Для контроля антигена в отдельные 2-3 пробирки разливают нормальную сыворотку того же вида животного, от которого получена преципитирующая сыворотка, сверху добавляют по 0,1 мл антигена, оставляют при комнатной температуре и учитывают через 1-2 минуты. Учет реакции. Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 минут, 1-2 часа или через 20-24 часа. В положительном случае на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета. Реакция считается положительной: 1 Если диск (кольцо) преципитата появляется вскоре после наслаивания антигена (или подслаивания сыворотки) через несколько минут (не позже 1-2); 2 Если в контрольных пробирках реакция отрицательная – нет преципитата (кольца). Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Провести исследование сыворотки крови животных реакцией агглютинации. Этапы выполнения задания: 1 Оценить пригодность сывороток крови животных к серологическому исследованию. 2 Освоить постановку РА классическим методом с единым бруцеллезным антигеном. 3 Освоить постановку РА пластинчатым методом с антигеном для розбенгал пробы. 4 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю. Практическое задание 2: Провести исследование кожевено-мехового сырья реакцией преципитации с целью диагностики сибирской язвы. Этапы выполнения задания: 1 Подготовить пробы кожевенно-мехового сырья к серологическому исследованию. 2 Освоить постановку РП методом кольцепреципитации с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой. 3 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Как проявляется РА и от чего зависит характер осадка (агглютината)? 2 Назовите методы постановки РА, в чем сходство и отличие этих методов? 3 Как проводят учет и оценку реакции при постановке разными методами? 4 Назовите компоненты РА, опишите методику получения антигена. 5 Какие контроли необходимы при постановке РА и почему? 6 Дайте определение понятия «преципитация». 7 Перечислите методы получения антигенов. 8 Укажите материал для проведения исследования. 9 Назовите методы постановки реакции преципитации. План 1. Реакция связывания комплимента (РСК) и ее разновидности. 2. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), методы постановки. Материальное обеспечение: свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных, антигены для РСК (стандартные антигены, выпускаемые биофабриками), диагностические специфические сыворотки, штатив с пробирками Флоринского, мерные пипетки, физ. раствор, люминесцентный микроскоп, исследуемый материал, люминесцирующая сыворотка в рабочем разведении, влажная камера, пипетки 1-2 мл, изотонический раствор натрия хлорида, дистиллированная вода. таблицы по теме занятия (Реакция связывания комплимента, Реакция иммунофлуоресценции). Теоретический материал Реакция связывания комплемента (РСК). Реакция связывания комплемента впервые описана Дж. Борде и О. Жангу в 1901году. РСК – сложная двухэтапная реакция, в которой связывание антигена с антителом идет в присутствии третьего компонента (комплемента). Образовавшийся комплекс не видим, поэтому используют дополнительную индикаторную систему (гемолитическую) как цветной показатель. РСК применяют для диагностики инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии (бруцеллёз, сап, листериоз, ящур, ИНАН и др.). В диагностических лабораториях РСК используют в двух направлениях: - обнаружение специфических антител в сыворотке крови больных с помощью стандартных антигенов. - выявление в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) с помощью специфических иммунных сывороток. Сущность реакции. В реакцию входят две системы: 1. бактериологическая (диагностическая); 2. гемолитическая (индикаторная). Бактериологическая система (баксистема) представлена испытуемой сывороткой и антигеном, гемолитическая (гемсистема) – гемолизином и эритроцитами барана. Гемолитическая система позволяет установить, произошла реакция в первой системе или нет. Гемолизин и эритроциты по отношению друг к другу тоже являются антителом (гемолизин) и антигеном (эритроциты). Комплемент занимает нейтральное положение и связывается с любой из систем, в которой образуется комплекс антиген-антитело. При наличии в испытуемой сыворотке антител, они вступают в реакцию с антигеном и комплемент связывается с образовавшимся комплексом в баксистеме. Гемолитическая система остается свободной, эритроциты барана оседают на дно пробирки в виде осадка, что указывает на положительную реакцию (отсутствие гемолиза). При отсутствии в испытуемой сыворотке специфических антител комплемент остается свободным, связывается с гемолитической системой и вызывает гемолиз эритроцитов барана (реакция отрицательная). Подготовка к исследованию. Все компоненты готовят непосредственно перед постановкой реакции. 1. Исследуемые и контрольные сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5, 1:10, инактивируют в водяной бане при 56-62°С (в зависимости от вида животного) 30 минут для освобождения от собственного комплемента. 2. Антигеном для РСК могут быть культуры убитых бактерий, их лизаты, экстракты из патологически измененных и нормальных органов, вирусы и вируссодержащие материалы, т.е. корпускулярные и растворимые антигены, не обладающие гемолизирующим свойством. 3. Комплемент – это сыворотка крови морской свинки (как наиболее чувствительный активный комплемент), выпускают биофабрики в лиофилизированном виде. Перед каждой постановкой РСК его титруют (проверяют активность). Титр комплемента – это его оптимальное количество, необходимое для данной реакции. 4. Гемолизин – это сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Готовят на биофабриках, на упаковке указывают его титр. 5. Эритроциты барана, их готовят в лаборатории. Отмытые эритроциты разводят 1:40. Перед постановкой РСК титруют один или несколько следующих Главный опыт РСК Порядок постановки реакции. Учитывая, что искомым является наличие антител в испытуемой сыворотке, постановку реакции начинают с баксистемы. Инактивированную и разведенную сыворотку (1:10) разливают в две пробирки по 0,5 мл. Следовательно, в штативы ставят два ряда пробирок с количеством пар, соответствующих числу исследуемых сывороток, плюс две пары (с нормальной – негативной и позитивной – положительной сыворотками) для контроля. Контроль должен быть всегда, независимо от количества исследуемых сывороток (даже одной пробы). Во все пробирки первого ряда сывороток добавляют по 0,5 мл антигена, второго ряда (без антигена) – по 0,5 мл физиологического раствора. Затем во все пробирки первого и второго рядов вносят по 0,5 комплемента, встряхивают и помещают в водяную баню (20-40 минут при 37-38 °С). После водяной бани во все пробирки первого и второго рядов добавляют компоненты гемсистемы по 0,5 мл (гемолизин и эритроциты барана), встряхивают и вновь помещают в водяную баню при тех же режимах. Учет и оценка реакции. Учет реакции начинают с контролей, при отсутствии их или, если они не работают, реакция считается не действительной. РСК сопровождается следующими контролями: - антигена; - комплемента; - гемолизина; - эритроцитов; - с позитивной сывороткой – заведомо положительный; - с негативной сывороткой – заведомо отрицательный. Задержка гемолиза должна наблюдаться только в контроле с позитивной сывороткой, в остальных гемолиз. Результаты реакции оценивают визуально дважды: - первый предварительный, сразу после водяной бани; - второй окончательный – через 18-20 часов пребывания пробирок при комнатной температуре. При первом учете обращают внимание на пробирки второго ряда и пробирки с нормальной сывороткой и антигеном, где начался гемолиз. В пробирках с позитивной сывороткой и антигеном гемолиз эритроцитов должен отсутствовать (эритроциты во взвешенном состоянии, жидкость мутная). Окончательный учет проводят на следующий день. Результаты РСК оценивают визуально в крестах: + + + + (#) – отсутствие гемолиза (полное осаждение эритроцитов), надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная; + + + – 25 % гемолиза эритроцитов, значительный осадок эритроцитов, жидкость слегка окрашена в розовый цвет; + + – 50 % гемолиза эритроцитов, осадок эритроцитов выражен, жидкость розового цвета; + – 75% гемолиза эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашена в красный цвет; - – 100 % (полный) гемолиз эритроцитов жидкость интенсивно окрашена в красный цвет – «лаковая кровь». Реакцию связывания комплемента считают положительной при оценке не ниже двух крестов. РСК при бруцеллезе. Комплементсвязывающие антитела при бруцеллезе были обнаружены в 1908 году в сыворотке крови людей, больных мальтийской лихорадкой (бруцеллезом). Причем в качестве антигена применяли различные штаммы бруцелл. Широкое применение РСК для диагностики бруцеллеза в нашей стране получила после того, как работами отечественных исследователей была установлена ее большая диагностическая ценность и некоторые преимущества по сравнению с реакцией агглютинации. Комплемент связывающие антитела в сыворотке зараженных животных появляются позднее, чем агглютинирующие. Поэтому отставание РСК от РА может быть на 10-15 суток (у овец), месяц и более (у коров). РСК в стадах с хронической инфекцией бруцеллеза выявляет большее количество реагирующих, чем РА. В нашей стране РСК для диагностики бруцеллеза животных используют с 1950 года. РСК с целью обнаружения специфических бруцеллезных антител в сыворотке крови животных применяют в следующих случаях: - контроль благополучия хозяйств; - исследование сыворотки крови от абортировавших коров; - контроль напряженности иммунитета у вакцинированных животных - во всех случаях подозрения бруцеллеза для установления диагноза. Реакцию ставят в соответствии с методическими указаниями по диагностике бруцеллеза от 1996 года. Принцип постановки реакции является общим с некоторыми особенностями. Особенности РСК при диагностике бруцеллеза: Сыворотки разводят 1:5, в качестве разбавителя используют физиологический раствор с добавлением солей хлористого магния и хлористого кальция, рН 7,3-7,4. В качестве антигена применяют единый бруцеллезый антиген для РА, РСК и РДСК, который представляет собой взвесь убитых бруцелл трех видов (Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis). Реакцию ставят в пробирках в объеме 1 см3 по 0,2 см3 каждого компонента (сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов барана) или в полистириловых пластинках с лунками. Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и выше с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Кроме того, контролем служат: · негативная сыворотка + АГ – отрицательная реакция; · позитивная сыворотка + АГ – положительная реакция; · антиген в двойной дозе без сыворотки Комплемент титруют в бактериологической системе. Титром комплемента считают его наибольшее разведение, давшее полный гемолиз 0,4 см3 гемолитической системы в присутствии негативной сыворотки и АГ в течение 20 минут в водяной бане (37-38°С). Учет и оценка реакции. Результаты РСК или РДСК учитывают визуально через 4-6 часов после окончания постановки или на следующий день при условии хранения штативов с реакцией при температуре 4-8°С. Реакцию оценивают в крестах. РСК и РДСК считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 креста в одном или нескольких разведениях сыворотки (1:5 и выше) и полном гемолизе эритроцитов в контроле (без антигена). Задержку гемолиза в один крест считают сомнительной реакцией и животных исследуют повторно через 15-30 дней. При этом животных, сыворотки крови которых, при повторном исследовании реагировали сомнительно в РСК (РДСК) считают реагирующими положительно. Использование РСК в диагностике вирусных болезней РСК применяют для диагностики многих вирусных болезней. Принцип постановки реакции остается тот же, различаются методы постановки в зависимости от цели исследования. Особенностью является то, что антиген довольно часто готовят непосредственно в лаборатории из органов больных (зараженных) животных, из алантоисной или амниотической жидкостей зараженных куриных эмбрионов, из жидкой среды инфицированных культур клеток. Подготовка антигена для РСК имеет свои особенности, что обусловлено рядом специфических свойств вирусов. При идентификации вирусов (антигена) в реакции используют стандартные специфические сыворотки, при обнаружении антител - стандартные антигены. Модификации РСК. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) отличается от РСК тем, что связывание идет при температуре +4°С. Реакция Вассермана (РВ) применяется при диагностике сифилиса в медицине. В качестве антигенов применяют экстракты из печени или других органов зараженных возбудителем сифилиса лабораторных животных. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) Флуоресценция – видимое свечение некоторых веществ под воздействием облучения их ультрафиолетовыми лучами (УФЛ). Такие вещества называют флуорохромы. К ним относят акридин оранжевый, родамин, сульфохлорид и другие красители. Эти флуорохромы при внесении в иммунные сыворотки или гамма-глобулины прочно присоединяют к антителам. Антитела становятся «меченными», то есть издают свечение при облучении их УФЛ. Сущность реакции и цель применения. Иммунофлуоресцентный метод основан на специфической реакции антигена с «меченными» флуорохромом антителами, результат которой можно увидеть в люминесцентный микроскоп. Возможность данного метода определяется сочетанием специфичности серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления реакции необходимо иметь высокоспецифичные иммунные флуоресцирующие сыворотки. В серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: антиген, антитело и комплемент. Все три компонента обладают антигенными свойствами и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки, и, соответственно, флуоресцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа флуоресцирующая сыворотка используется (против антигена, антител или комплемента) различают три основных варианта РИФ: прямой, непрямой варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Методы постановки реакции иммунофлуоресценции. Прямой метод предложен Кунсом в 1950 году. Этот метод применяют для обнаружения бактерий и вирусных антигенов в патологическом материале, объектах внешней среды, и для идентификации возбудителей заболеваний в культурах. Схема постановки прямой РИФ. На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают и фиксируют ацетоном в течение 5 минут. Затем на препарат наносят люминесцирующую сыворотку и помещают его во влажную камеру при температуре 37 °С на 15-20 минут. Затем для удаления избытка флуоресцирующих антител препарат промывают изотоническим раствором натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течении 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод (двухступенчатый) предложен Кунсом в 1954 году. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидовым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулином того вида животного, от которого была использована иммунная сыворотка. Схема постановки непрямой РИФ. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15-20 минут. Затем промывают (см. прямой вариант), подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антивидовой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15-20 минут. Повторяют процедуру промывания и высушивают фильтровальной бумагой. Непрямой антикомплементарный (трёхступенчатый) вариант открыт в 1958 году. Непрямые варианты можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Схема постановки трёхступенчатого варианта РИФ. Реакция идет в три этапа. 1 этап. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают. 2 этап. На мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную камеру и в термостат на 15-20 минут, после чего промывают. 3 этап. На препарат наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Обязательными в любой модификации РИФ являются три контроля: 1) обработка флуоресцирующими антителами суспензии гомологических бактерий (положительный контроль); 2) обработка флуоресцирующими антителами суспензии гетерологичной культуры (отрицательный контроль); 3) обработка флуоресцирующими антителами суспензии незараженного материала (отрицательный контроль). Оценка результатов. Необходимо учитывать яркость и цвет свечения. Интенсивность свечения оценивают по четырёхбалльной системе: ++++ - очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки; +++ - яркая флуоресценция периферии клетки; ++ - слабое свечение периферии клетки; + - нет контрастного свечения периферии и тела микробной клетки. Риф имеет ряд преимуществ: - является экспресс-методом, позволяющим провести исследования в течение 2-3 часов. - идентификацию можно проводить в нативном материале (органы, ткани животных), без выделения чистой культуры. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Провести исследование сыворотки крови животных реакцией связывания комплемента. Этапы выполнения задания: 1 Оценить пригодность сывороток крови животных к серологическому исследованию. 2 Освоить постановку РСК с единым бруцеллезным антигеном. 3 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю. Практическое задание 2: Освоить технику постановки РИФ прямым методом. Этапы выполнения задания: 1 Приготовить мазки-отпечатки, подсушить их и зафиксировать ацетоном. 2 .Нанести на препарат люминесцирующую сыворотку и поместить его во влажную камеру при температуре 37 °С на 15-20 минут. 3 Промыть препарат, оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 В чем заключается сущность РСК? 2 Назовите компоненты реакции, их значение. 3 Какова роль бактериологической и гемолитической систем в РСК? 4 Как проводят учет и оценку РСК? 5 С какой целью применяют РСК и ее разновидности в ветеринарной практике? 6 Поясните понятие «флуоресценция». 7 В чем заключается сущность реакции иммунофлуоресценции? 8 Назовите методы постановки РИФ, поясните их отличия. 9 Как проводят учет и оценку реакции иммунофлуоресценции? 10 Какие преимущества имеет реакции иммунофлуоресценции? План 1. ДНК-ДНК гибридизация. 2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 3. Учебный фильм ПЦР Материальное обеспечение: микробные культуры, мультимедийное оборудование, таблицы по теме занятия (Постановка ПЦР). Теоретический материал Метод ДНК-ДНК гибридизации с использованием нитроцеллюлозных фильтров позволяет определить гомологию нуклеотидных последовательностей ДНК не только на уровне родов, но и видов одного рода. Для идентификации и дифференциации микроорганизмов наряду с морфологическими, культуральными и биохимическими признаками широко используют результаты изучения молекулярной структуры нуклеиновых кислот. Исследование нуклеиновых кислот позволяет получить полную характеристику о микроорганизме, так как первичная последовательность ДНК содержит информацию о структурных и энзиматических белках, определяющих фенотип организма. Кроме того, последовательность и число нуклеотидных замен ДНК отражают происхождение и развитие организма. Этапы проведения исследования: 1) Культивирование микроорганизмов, получение биомассы. 2) Выделение ДНК микроорганизма. ДНК выделяют в два этапа: разрушение клеточной стенки и последующая экстракция нуклеиновых кислот из лизата. 3) Определение нуклеотидного состава микробного штамма по температуре плавления ДНК. Нуклеотидный состав исследуемого штамма определяют спектрофотометрически по тепловой денатурации. 4) Молекулярная гибридизация ДНК. В качестве реперного штамма (штамма сравнения) используют референтные штаммы с известными характеристиками. Гибридизацию проводят 48 часов. 5) Учет реакции ДНК-ДНК гибридизации. Учет степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК проводят, принимая за 100% радиоактивность гомологичной реакции. Микроорганизмы относят к определенному виду в случае содержания ГЦ пар – 58-59 мол. % и 90-100 % гомологии нуклеотидных последовательностей с ДНК реперного штамма микроорганизма. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, позволяющий обнаружить нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) вируса в любом материале с точностью до одной молекулы. ПЦР состоит из нескольких этапов, которые проводятся в специальных помещениях. Сотрудники лаборатории, участвующие в ПЦР – диагностике, работают в одноразовой стерильной спецодежде, которую сменяют на каждом этапе реакции. 1 этап – подготовка проб проводится в боксе. Обработку материала проводят в ламинарном шкафу, в стерильных условиях. Дополнительно непосредственно перед работой все поверхности протирают салфеткой, смоченной 70% этиловым спиртом. Из биоматериала готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию тщательно перетирают в ступке со стеклянным порошком до получения гомогенной массы и отстаивают 15 минут для осаждения крупных частиц суспензии. Микродозатором суспензию переносят в одноразовую пластиковую пробирку объемом 1,5 мл. Для каждой пробы используют одноразовый наконечник с аэрозольным барьером. Суспензию ценгрифугируют при 10 тыс. об/мин. 30 секунд с целью осаждения грубых частиц тканей и осветления суспензии. Пробирка с суспензией передается в соседнее помещение через специальное окно для дальнейшей работы. Все рабочие поверхности в ламинарном шкафу вновь обрабатываются 70% спиртом. 2 этап – выделение нуклеиновых кислот проводится в специальном боксе, оснащенным необходимым оборудованием, одноразовыми расходными материалами и спец. одеждой. Набор реактивов включает: лизирующий раствор, отмывочные растворы под номерами 1, 3, 4 и РНК-элюэнт. Перед работой все рабочие поверхности, оборудование обрабатывают спиртом. В штатив устанавливают две одноразовые пластиковые пробирки (для исследуемой пробы и отрицательного контроля), нумеруют их. В каждую пробирку микродозатором вносят 450 мкл лизирующего раствора, затем в первую – исследуемый материал, во вторую – физ. Раствор в объемах по 100 мкл. Содержимое пробирок тщательно и быстро перемешивают на вортексе. Протеаза и комплекс солей, входящие в лизирующий раствор, разрушают весь белок пробы до аминокислот. Нуклеиновые кислоты вируса остаются в неизменном виде. Отделение нуклеиновой кислоты от лизирующего раствора проводят специальным сорбентом, который добавляют по 2,5 мкл в каждую пробирку. Сорбент предварительно перемешивают на вортексе. Пробы дважды ресуспендируют на вортексе и оставляют на 5 минут в штативе для окончания процесса сорбции нуклеиновой кислоты. Сорбент осаждают путем центрифугирования проб при 10 тыс. об/мин. В течение 30 секунд. Вакуумным отсасывателем с одноразовыми наконечниками удаляют надосадочную жидкость из обеих пробирок. Осадок двукратно последовательно отмывают растворами №1,3,4. Пробы ресуспедируют на вортексе, центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют. В каждую пробирку с подсушенным сорбентом вносят по 25 мкл раствора РНК элюэнта, ресуспендируют на вортексе, центрифугируют при 12-13 тыс.об/мин. в течение 1 минуты. В результате нуклеиновая кислота переходит в буфероный раствор. Надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновую кислоту, микродозатором переносят в чистую пробирку. Пробирки маркируют и передают в следующее помещение. 3 этап – амплификация (главный этап ПЦР) проводится в специально оборудованном помещении, отдельным персоналом. Процесс амплитфикации представляет собой многократное копирование специфического для каждого вида возбудителя фрагмента ДНК. Количество фрагментов увеличивают на столько, что их можно обнаружить методами электрофореза или ДНК-зондов. В аплификации используют только ДНК возбудителя. Поэтому выделенную РНК переводят в ДНК реакцией обратной транскрипции. Методика проведения реакции обратной транскрипции. В пробирку с реакционной смесью (буферный раствор + нуклеотиды+ фермент обратной транскриптазы) вносят выделенную РНК. Реакция протекает в термостате при температуре 37ºС 30 минут. Фермент обратной транскриптазы (ревертаза) выстраивает из нуклеотидов реакционной смеси цепь ДНК на исходной молекуле нуклеиновой кислоты. Полученная копийная ДНК для постановки ПЦР разводится в 5 раз ДНК буфером и может храниться при температурах -16ºС неделю, -70ºС один год. Проведение амплификации. В четыре пробирки с реакционной смесью №1 (праймеры) вносят реакционную смесь №2(ДНК-полимераза + нуклеотиды для постановки ДНК) в объеме 10 мкл. Восковая подушка разделяет реактивы смесей и не позволяет запустить реакцию. Затем вносят по 1 капле масла для ПЦР, чтобы исключить испарение компонентов смеси во время реакции. На минеральное масло или под него вносят по 10 мкл: - в пробирку №1 – копийную ДНК исследуемой пробы; - в пробирку №2 – отрицательный контроль этапа выделения нуклеиновой кислоты; - в пробирку №3 – положительный контроль – к ДНК с РНК вируса; - в пробирку №4 –отрицательный контроль ДНК-буфер. Реакцию проводят в амплификаторе Ампли-4 производства «Биоком». Сначала устанавливают программу, обеспечивающую необходимую температуру реакции. Пробирки помещают в ячейки только после нагрева амплификатора до температуры 95ºС, закрывают крышку и запускают программу. Время амплификации составляет 1 час 50 минут – 2 часа 30 минут, что составляет 35-42 цикла. В течение каждого цикла проходят следующие этапы: плавление ДНК, отжиг праймеров и построение специфического фрагмента. В результате амплификации образуется примерно 100 миллионов копий специфического фрагмента. 4 этап – анализ продуктов ПЦР проводится в специальном помещении, расположенном как можно дальше от других объектов с целью исключения заноса летучих продуктов ПЦР в реакционные смеси. Анализ проводят методом электрофореза. Приготовленный агарозный гель заливают в форму камеры для электрофореза толщиной 0,6 см. После застывания агара под буферный раствор в лунки вносят продукты амплификации последовательно из четырех пробирок. Камеру подключают к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется всегда к + электроду). Электрофорез длится 18-20 минут. Затем буферный раствор сливают, а гель переносят на стеклянную пластину и помещают на транс иллюминатор. На мониторе компьютера с помощью видеосистемы получают изображение геля. Учет результатов проводят по наличию или отсутствию электрофореграмме специфических светящихся полос амплифицированной ДНК. Начинают с контролей. На дорожке «+» контроля должна быть светящаяся полоса, а на дорожке «-» контроля –нет. На более современных амплификаторах (Био-ред «Циклер») амплификация и анализ её результатов объединены в одном этапе. Результаты анализа продуктов амплификации в этом случае выводятся на монитор компьютера в виде графических кривых, соответсвующих контролям и исследуемой пробе. Это позволяет сократить время анализа, затраты на оборудование, отпадает необходимость дополнительного помещения. В учебном фильме Вы познакомитесь с техникой проведения полимеразной цепной реакцией (ПЦР). В фильме представлено одно из направлений деятельности Челябинской межобластной лаборатории - диагностика вирусных болезней животных. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Провести подготовку микробных культур к исследованию в реакции ДНК-ДНК гибридизации. Этапы выполнения задания: 1 Приготовить из микробной культуры мазок-препарат, окрасить по Граму, микроскопировать. 2 Определить форму микробных клеток и чистоту культуры. 3 В случае обнаружения смешанной микробной культуры, выделить чистую культуру общепринятыми методами. 4 Провести посев чистой микробной культуры с целью накопления биомассы. Практическое задание 2: Усвоить технику постановки полимеразной цепной реакци (ПЦР). Этапы выполнения задания: 1 Внимательно посмотреть учебный фильм. 2 Выделить основные этапы проведения ПЦР. 3 Обсудить методику постановки ПЦР, подвести итоги занятия. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 С какой целью применяют генетические методы диагностики в микробиологической практике? 2 на чем основан метод ДНК-ДНК-гибридизация? 3 Перечислите этапы проведения ДНК-ДНК-гибридизации. 4 Как определяют нуклеотидный состав микроорганизмов? 5 Как проводят учет и оценку реакции ДНК-ДНК-гибридизации? 6 В каких условиях проводят ПЦР? 7 Перечислите этапы проведения ПЦР. 8 В чем состоит методика проведения реакции обратной транскрипции? 9 Дайте определение понятия «амплификация». 10 С какой целью применяют метод электрофореза в ПЦР? План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Лабораторные методы диагностики стафилококкозов. 3. Лабораторные методы диагностики стрептококкозов. Материальное обеспечение: микроскоп, гнойный экссудат от больного животного, пробы молока от коров, больных маститом и здоровых. Питательные среды: МПБ, МПА, солевой и кровяной МПА, глюкозо-сывороточный МПБ, пробирки с цитратной плазмой кролика, пастеровские пипетки, МПА кровяной и солевой в чашках Петри, диски с антибиотиками и бромтимоловым индикатором, предметные стекла, стерильные пробирки, пипетки, бактериологические петли, набор бактериологических красок, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, иммерсионное масло, микроскоп, демонстрационные среды в чашках Петри, культуры стафилоккоков и стрептококкоков с изученной антибиотикочувствительностью. Таблицы (Микробный состав молока коров, больных разными формами мастита; Гемолитическая активность патогенных кокков на кровяном агаре). Теоретический материал Лабораторная диагностика стафилококкозов. Патологический материал: раневой экссудат, гной абсцессов, молоко при маститах, кровь при септицемии, продукты при пищевых отравлениях. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Прямая микроскопия позволяет дать только предварительный ответ. Одновременно сеют материал в чашки с кровяным, молочно-солевым и желточно-солевым агаром. Патогенные штаммы на кровяном агаре образуют вокруг колоний зону гемолиза. На чашках с молочно-солевым агаром учитывают образование пигмента. На желточно-солевом агаре большинство патогенных стафилококков вызывает лецитовителлазную реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком по периферии. Ставят реакцию плазмокоагуляции с цитратной плазмой крови кролика. При наличии у стафилококка фермента коагулазы плазма свертывается. При необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей ее распространения, выделенные культуры подвергаются фаготипированию. Международный набор стафилококковых фагов состоит из 22 типов, разделенных на 4 группы. Энтеротоксины в пищевых продуктах и культурах определяют в РДП со стафилококковыми антисыворотками к энтеротоксинам А, В, С, D, Е, F. В связи с широким распространением штаммов стафилококков, резистентных к лекарственным препаратам, проводят определение чувствительности выделенных стафилококков к антибиотикам на плотной среде методом бумажных дисков или реплик. Это очень важно для выбора рациональной химиотерапии. Основным местом обитания стафилококков являются слизистые оболочки верхних дыхательных путей человека и животных. Гноеродные стафилококки можно легко обнаружить на предметах, расположенных в непосредственной близости к человеку, животным. Это позволяет отнести их к микроорганизмам – индикаторам воздушно-капельного загрязнения некоторых объектов внешней среды. При подтверждении диагноза молоко коров, больных маститами, рекомендуется кипятить и использовать для кормовых целей, так как токсины и другие продукты патологического обмена ухудшают его качество и его делают совершенно не пригодным в пищу. Продажа молока от маститных коров запрещена. Блюда, изготовленные из рыбы и морепродуктов, могут быть источником пищевой интоксикации. Посол рыбы не гарантирует исключение возможности образования токсина, т.к. стафилококк является галлофилом. В продуктах с наличием стафилококков и их токсинов органолептические изменения не происходят. Интоксикации стафилококкового происхождения связаны с накоплением в инфицированной пище энтеротоксина. Классическое проявление поражения человека отмечается, когда в продукте (1 г) содержится 105-107 стафилококков, способных вырабатывать токсин, менее 1 мкг которого вызывает пищевую интоксикацию. У больных стафилококкозом птиц наблюдаются явления септицемии. У взрослых – часто возникают артриты, дерматиты и тендовагиниты. При генерализованном процессе (абсцессы в суставах, изменения в органах) всю тушку вместе с органами направляют на техническую утилизацию. Патогенные стрептококки у животных и человека заселяют слизистые оболочки, кожу и проявляют свою патогенность при снижении общей резистентности организма животного или отдельных тканей (при травме, ожоге и т.п.). В естественных условиях стрептококки являются возбудителями заболеваний крупного рогатого скота и лошадей, а также нагноительных процессов. У поросят и птиц вызывают септическое заболевание – стрептококкоз (стрептококковая септицемия). Иногда обусловливают осложнение вирусных и бактериальных инфекций. Стрептококки в течение нескольких дней могут сохраняться на предметах, окружающих больного, и в пыли. После высыхания они сохраняют жизнеспособность, но уже через несколько часов пребывания в воздухе теряет свою вирулентность. Морфология. Шаровидные, не образующие спор бактерии, размером 0,2-2,0 мкм, грамположительные, располагаются парами или короткими цепочками. Культивирование. На поверхности сывороточного МПА - стрептококки образуют мелкие, росинчатые колонии; на МПБ – бульон остается прозрачный, но на дне пробирки собирается мелкозернистый осадок. Токсины и факторы патогенности. Патогенные стрептококки продуцируют экзотоксины различного действия: гемолизин, лейкоцидин, летальный токсин (некротоксин). Кроме экзотоксинов патогенные стрептококки продуцируют следующие ферменты: гиалуронидазу, фибринолизин, дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу, нейраминидазу, протеиназу, стрептокиназу, амилазу, липазу, а также эндотоксины, которые характеризуются термостабильностью. Все стрептококки разделены на три группы по гемолитической активности на агаре с кровью барана: 1)гемолитические (образуют бета-гемолиз, полностью гемолирующие), 2) зеленящие (образуют альфа-гемолиз, дающие частичный гемолиз), 3) негемолитические. Стрептококки являются постоянными обитателями полости рта и верхних дыхательных путей человека и животных. В большом количестве альфа- и бета-гемолитические стрептококки выделяются в окружающую среду при кашле и чихании, наличие их в определенных объемах воздуха позволило некоторым исследователям рекомендовать их в качестве санитарно-показательных бактерий. Тушки и внутренние органы больных стрептококковой септицемией птиц утилизируют. Яйца, полученные от птиц, благополучных по стрептококкозу групп, дезинфицируют и вывозят в сеть общественного питания, где используют в вареном виде, о чем указывается в ветеринарном свидетельстве. Их можно направлять для изготовления хлебобулочных и кондитерских изделий. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схемы проведения лабораторного исследования на кокковые инфекции. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований на стафилококковые инфекции и мастит коров. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики . 3 Определите необходимость и порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схемы исследований зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробных культур. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте мазки-препараты из гнойного экссудата и молока, зафиксируйте их. 2 Окрасьте мазки-препараты по методу Грама и простым методом. 3 Микроскопируйте окрашенные препараты, используя иммерсионную систему микроскопа, зарисуйте и опишите морфологические особенности стафилоккоков и стрептококков в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства музейной микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Опишите характер роста микробной культуры на сывороточном агаре. 2 Опишите характер роста микробной культуры на МПА. 3 Опишите характер роста микробной культуры на сывороточном агаре. 4 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробной культуры и сделайте заключение о соответствии ее сибириязвенным бациллам Практическое задание 4:.Проведите бактериологическое исследование молока коров с целью обнаружения возбудителей мастита. Этапы выполнения задания: 1 Проведите посев молока коров в питательные среды (кровяной агар, сывороточный агар, солевой агар, МПА, МПБ). 2 Посевы поместите в термостат для культивирования. 3 На следующем занятии изучите культуральные и морфологические свойства выросших культур. 4Определите чувствительность выделенных микробных культур к антибиотикам. 5 Сделайте заключение по диагностике мастита и лечению больных животных. Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при стафилококкозах и стрептококкозах. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните порядок отбора патологического материала от больных животных при подозрении на мастит. 2.Какой материал подлежит исследованию на кокковые инфекции? 3 Назовите методы лабораторной диагностики инфекционных болезней, обусловленных патогенными и условно-патогенными стафилококками. 4 Какие методы применяют для определения токсигенности возбудителей? 5 Назовите биологические препараты, применяемые для профилактики стрептококковой септицемии телят. 6 Назовите возбудителей стрептококкозов. 7 Какие болезни сельскохозяйственных животных вызывают патогенные стрептококки? 8 С какой целью проводят посев патологического материала на кровяной агар? 9 Что означает термин «галофилы»? 10 На основании результатов каких исследований патологического материала можно установить окончательный диагноз на инфекционную болезнь? 11 Опишите характер роста Staphylococcus aureus на солевам агаре. 12 Какие виды кокков можно выявить на питательных средах с желчью? 13 Каким методом определяют патогенность стрептококков и стафилококков?
План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Бактериологические методы диагностики сибирской язвы. 3. Серологические методы диагностики сибирской язвы. Материальное обеспечение: демонстрационные мазки листерий и возбудителя рожи свиней, биопрепараты (вакцины, гипериммунные сыворотки) против рожи свиней и листериоза; труп белой мыши в кювете, стерилизатор с инструментами (скальпели, ножницы, пинцеты), тампоны с 70 % спиртом, спички, микроскоп, предметные стекла, спиртовки, культуры музейных вакцинных штаммов грампозитивных палочек, выращенные на МПА и МПБ, набор красок для окрашивания по Граму. Таблицы («Схема бактериологической диагностики листериоза», «Схема бактериологического исследования на рожу свиней», «Дифференциация листерий от рожистой палочки»). Теоретический материал 1. Бактериологическая диагностика листериоза включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурально-биохимическим, тинкториальным и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных. Микроскопическое исследование. Микроскопическому исследованию подвергают мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков чистым предметным стеклом 3-4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из патматериала, а также после подращивания его проб при 37 °C в течение 4-6 часов. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флюоресцирующих антител. Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes - грамположительная подвижная неспорообразующая полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5 - 2,0 мкм. Бактериологическое исследование. Из органов и обязательно головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физрастворе в соотношении 1:5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычные среды с добавлением 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина или печеночный агар и бульон (pH среды 7,2 - 7,4), а также кровяной агар и элективные среды (Приложение 10.2). В качестве дополнительного метода при отрицательном результате первичного посева рекомендуется часть исследуемого материала поместить в холодильник и хранить в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней. При исследовании абортированных плодов посевы делают из содержимого желудка и внутренних органов. При исследовании истечений из половых органов, молока и силоса посевы проводят на печеночный агар в чашках и МПБ с 10% хлорида натрия, из которого потом делают пересевы на твердые среды. Посевы инкубируют в термостате при 37° с ежедневным просмотром в первые 3 - 4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение двух недель. Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бета-гемолиза на кровяном агаре. Колонии листерий в проходящем свете имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. Из выделенной культуры делают мазки, окрашивая их по Граму, а также для люминесцентной микроскопии с применением прямого и непрямого метода флюоресцирующих антител. Биологическое исследование проводят на 2 - 3 белых мышах (масса 14 - 16 г). Животных заражают под кожу или внутрибрюшинно суспензией из головного мозга и внутренних органов или культурой в дозе 0,3 - 0,5 мл. При положительной биопробе животные погибают через 2-6 суток после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть. При наблюдении более 10 дней рекомендуется дополнительно делать посев из головного мозга. Очень чувствительны к подкожному заражению 5- 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18 - 36 часов. К заражению листериями восприимчивы и кролики. Показательно внутривенное заражение кроликов культурой листерий в дозе 0,5 - 1 млрд. микробных тел (по стандарту мутности), при этом количество моноцитов в крови зараженных животных увеличивается в несколько раз. Это является дополнительной характеристикой возбудителя болезни. Из внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце) павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды. Срок наблюдения за подопытными животными - 14 суток. Идентификация микробной культуры Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли, а также посевом методом укола в полужидкий МПА. На подвижность исследуют 6-18-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре (22 °C). Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью. Для определения ферментативных свойств чистую бульонную культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, маннит, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза), который выдерживают при 37 °C в течение 10 дней. Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, трегалозу, салицин и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу, маннит. Проба на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленной 5-процентной перекиси водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель перекиси водорода. При наличии фермента каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пена). Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий при дифференциации от возбудителя рожи свиней. Определяют чувствительности листерий к бактериофагам. Культуру признают листериями, если в месте нанесения одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона зона лизиса отсутствует. Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого (ПМФА) и непрямого методов флюоресцирующих антител (НМФА). С помощью этих методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность. Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды; метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий. Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред. Серологическая идентификация листерий. Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах. На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физраствора. К обеим каплям на стекле добавляют по одной капле смыва культуры, смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекла плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно для контроля один раз в день исследуют на стекле каплю сыворотки с добавлением капли физраствора. Учет результатов РА проводят в течение 3-х минут. Реакция считается положительной при появлении четкой агглютинации (образование хлопьев) в капле с сывороткой при ее отсутствии в контроле. Запоздалые реакции не учитывают. Исследуемую культуру признают листериями при получении положительной реакции с поливалентной сывороткой и отсутствии агглютинации в контроле с физраствором, а также наличии характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств. Специфические свойства листерий проверяют также конъюнктивальной пробой на морских свинках или дермонекротической пробой на морских свинках или кроликах. Конъюнктивальная проба. На конъюнктиву глаза морской свинки наносят 2 капли испытуемой бульонной культуры с последующим легким массажем век ватным тампоном. Вирулентные штаммы листерий на 2-4 день вызывают у морской свинки гнойный кератоконъюнктивит. Пробу с каждым штаммом желательно ставить не менее чем на двух морских свинках. Дермонекротическая проба. В тщательно выстриженный участок кожи бока морской свинки или кролика внутрикожно вводят 0,3 - 0,5 мл бульонной культуры. Через 24 - 48 часов возникает воспаление с последующим некрозом и образованием струпа. На одной морской свинке можно ставить конъюнктивальную и дермонекротическую пробу при изучении свойств одного штамма. При необходимости испытания нескольких культур в выстриженный участок кожи на правом и левом боку кролика можно инъецировать по 3 культуры с каждой стороны. Диагноз на листериоз считается установленным при получении положительного результата РНФ; обнаружении листерий в патматериале иммунофлюоресцентным методом, а также при выделении грамположительной полиморфной подвижной палочки, образующей каталазу и разлагающей с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, трегалозу и салицин; вызывающей (вирулентные штаммы) положительные конъюнктивальную и дермонекротическую пробы у морских свинок и кроликов; дающей положительную РА с листериозной сывороткой; лизирующейся листериозным бактериофагом; обладающей патогенностью для лабораторных животных (вирулентные штаммы). Диагноз на рожу свиней устанавливают на основании эпизоотологических данных (заболевание молодых свиней и поросят отъемного возраста, возникающее обычно в жаркое время года), клинических признаков (красные пятна на коже, имеющие форму различных геометрических фигур, высокая температура), данных вскрытия (катаральное и катарально-геморрагическое воспаление желудка и тонкого отдела кишечника, серозный перикардит, бородавчатый эндокардит, неравномерная окраска миокарда, венозный застой и кровоизлияния в почках), а также результатов бактериологических исследований патологического материала от больных и павших животных. Диагностика рожи свиней представлена в схеме 1 [3,7]. Диагноз на рожу свиней считают установленным окончательно в одном из следующих случаев: - при обнаружении возбудителя рожи свиней в исходном патологическом материале методом люминесцентной микроскопии (без выделения чистой культуры); - при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя болезни; - при гибели зараженных животных и выделении из их органов культуры возбудителя, даже если в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено. При вскрытии не всегда удается определить причину смерти животного. На бактериологическое исследование посылают отдельные органы, части органов, кости или целые трупы мелких животных с нарочным. Во избежание распространения инфекции посылаемый материал должен быть завернут в мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором, хорошо упакован в плотный деревянный или металлический ящик, выстланный полиэтиленом. Целые трупы или органы отправляются для исследования в стеклянных банках, металлических ведрах или банках с крышками. В случаях, когда из-за дальности расстояния в свежем виде материал доставить невозможно, его консервируют в 30-%ном водном растворе глицерина. Материал можно замораживать и в термосе со льдом доставлять в лабораторию. При этом следует учитывать, что материал должен быть доставлен в лабораторию не позднее 4-6 часов после гибели животного и от животных, которые при жизни не подвергались лечению. В противном случаи возможны диагностические ошибки. При роже свиней для исследования берут целый труп или селезенку, измененные части органов (почки) и трубчатую кость, очищенную от мяса. Летом кусочки почек, селезенки и целиком лимфатические узлы, в 30-40 %м глицерине или в насыщенном растворе поваренной соли. Кровь посылают в запаянной пипетке. Пораженные участки кожи, трубчатую кость пересыпают сухой поваренной солью. Бактериологическая диагностика Для микроскопии готовят мазки-отпечатки из почек, селезенки, печени, пораженных участков кожи, сердца или из выделенной культуры возбудителя. Для получения чистой культуры возбудителя рожи высевы из патологического материала проводят на обычные и элективные питательные среды. Обычно посевы делают на хорошо просветленных мясопептонных бульоне и агаре или бульоне Хоттингера при рН 7,4-7,8. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° С в течение 24-48 часов. Полученную культуру микроскопируют, изучают ее культуральные, биохимические свойства. Чистую культуру пересевают на полужидкий 0,2%-ный агар (для определения подвижности макрометодом), мясопептонную желатину, пептонную воду с полоской реактивной бумаги (для изучения возможности возбудителя выделять сероводород), на среды Гисса с углеводами, на индикаторные среды, в две пробирки с мясопептонным бульоном для проб на образование каталазы. Дифференциальная диагностика Рожу свиней дифференцируют от классической чумы, пастереллёза, листериоза, сибирской язвы, солнечного и теплового удара, а также веррукозных эндокардитов. Серологическая диагностика Из серологических методов диагностики применяют реакцию агглютинации (РА) в двух модификациях: пластинчатую и пробирочную, пробу роста. Некоторые исследователи рекомендуют использовать РНГА и РТГА. Однако не все перечисленные серологические реакции дают четкую зависимость между титром противорожистых антител и иммунной защитой. Срок лабораторного исследования, с целью постановки диагноза на рожу свиней, составляет 7 дней. Обнаружение и идентификация возбудителя рожи свиней в чистых, смешанных культурах и патологическом материале определяют и с помощью люминесцирующей рожистой сыворотки. Биопробу проводят на голубях и белых мышах. Заражают их в день поступления патологического материала суспензией в разведении 1:5, а затем суточной бульонной культурой. Заражение мышей производят подкожно в дозе 0,1-0,2 см3 , голубей - внутримышечно в дозе 0,2-0,3 см3. В случае положительного диагноза на рожу свиней мыши должны погибнуть через 3-4 суток, а голуби - через 2-5 суток. Наблюдение за зараженными животными и птицей проводят в течение 6 суток. Из органов павших мышей и голубей делают высевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя рожи свиней. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схемы проведения лабораторного исследования на листериоз и рожу свиней. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики болезней. 3 Определите необходимость и порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте мазки-препараты из музейных культур, зафиксируйте их. 2 Окрасьте мазки-препараты по методу Грама. 3 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителей в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПБ. 2 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПА. 3 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробных культур и сделайте заключение о соответствии ее листериям или рожистой палочке. Практическое задание 4: Дифференцировать возбудитель рожи свиней от листерий. Этапы выполнения задания: 1 Выяснить морфологические отличия возбудителей листериоза и рожи свиней. 2 Определить отличительные особенности ферментативной активности возбудителей болезни. 3 Установить восприимчивость лабораторных животных к возбудителям рожи свиней и листериоза. 4 Провести серологическую типизацию возбудителей. 5 Анализировать полученные результаты, сделать заключение и отчитаться преподавателю. Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при сибирской язве. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Какой материал направляют для исследования в лабораторию на рожу свиней? 2 Поясните порядок исследования биоматериала на рожу свиней. 3 Какими биологическими особенностями обладает возбудитель рожи свиней? 4 Назовите и охарактеризуйте биопрепараты, применяемые при роже свиней. 5 Какой материал направляют для исследования в лабораторию на листериоз? 6 Поясните порядок исследования биоматериала на листериоз. 7 Назовите отличительные особенности биологических свойств возбудителя листериоза от рожистой палочки. 8 Какие патогенные микроорганизмы необходимо дифференцировать от листерий и рожистой палочки? 9 Дайте характеристику биопрепаратам, применяемым при листериозе. 10 Поясните культуральные свойства возбудителя рожи свиней и листерий.
План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Бактериологические методы диагностики сибирской язвы. 3. Серологические методы диагностики сибирской язвы. Материальное обеспечение: микроскоп, толстые мазки крови, марлевые повязки, краски по Граму, спиртовки, сибиреязвенный антиген, сибиреязвенная преципитирующая сыворотка, экстракт из кож, уленгутовские пробирки и воронки, пастеровские пипетки, культура возбудителя сибирской язвы на МПА, МПБ, МПЖ, спички, тампоны с 70 %-ым спиртом, пробы кожевенно-мехового сырья, набор для постановки реакции преципитации (РП). Биологические препараты: антиген сибиреязвенный, преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, вакцины, гипериммунная сыворотка. Таблицы (Морфология возбудителя сибирской язвы; Характер роста на питательных средах МПБ, МПЖ, МПА; РП). Теоретический материал Сибирская язва (Anthrax) – зооантропоноз. К ней восприимчивы животные многих видов, особенно травоядные, и человек. Инфекционный процесс протекает преимущественно остро с явлениями септицемии или с образованием различной величины карбункулов. Возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis (Koch, 1872) – типичный представитель патогенных бацилл. Относится к семейству Bacillaceae и роду Bacillus. Этот микроб часто называют бациллой антракса. В случае гибели животных с подозрением на сибирскую язву трупы вскрывать запрещено – их сжигают. Для лабораторного исследования отправляют ушную раковину с нижней стороны (на которой лежал труп). Предварительно ухо перевязывают в двух местах крепким шпагатом, отрезают, место отреза немедленно прижигают, чтобы предотвратить истечение крови и обсеменение почвы возбудителем (споры сибиреязвенных бацилл сохраняются в почве сотни лет). Ухо заворачивают в марлю, пропитанную 3%-ным раствором борной кислоты, помещают в двойной полиэтиленовый мешочек и транспортируют в герметичной емкости. В лабораторию можно направлять толстые мазки крови из надреза сосудов уха, мазки кладут в чашки Петри или другую емкость, на которой делают надпись: «Мазок не фиксирован!». При возникновении подозрения на сибирскую язву во время убоя и переработки туш, убой немедленно приостанавливают, берут пробу из измененных органов и тканей и немедленно направляют в лабораторию. От свиней направляют заглоточные и подчелюстные лимфоузлы, отечную ткань в области шеи, так как у них болезнь протекает в ангинозной форме. Таким же образом поступают при поступлении туш мяса на рынки. В лаборатории из доставленного материала немедленно готовят мазки, окрашенные по Граму и специальным методом на капсулу (Ольта, Михина). При обнаружении в мазках цепочек крупных Гр+ палочек, окруженных капсулой, немедленно дают предварительный ответ по месту гибели животных, убоя или экспертизы, ставят в известность ветеринарную и медицинскую службу. Сибиреязвенную тушу со шкурой и органами отправляют на утилизацию. Утилизируют также и продукты убоя. Исследованию на сибирскую язву подлежит также мясо, полученное от вынужденно убитых животных. При необходимости исследуют пробы почвы (особенно в местах старых скотомогильников), пробы воды и других объектов внешней среды. Порядок исследования. 1. Микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму и специальным методом на капсулу. В мазках из патологического материала, из крови, органов обнаруживают короткие цепочки Гр+ палочек, окруженных капсулой. (Необходимо иметь в виду, что капсула образуется только в организме!). Для обнаружения (индикации) возбудителей сибирской язвы во внешней среде используют метод флюоресцирующих антител (МФА). 2. Выделение чистой культуры возбудителя проводят путем посева на обычные питательные среды МПБ, МПА, МПЖ, на которых наблюдается характерный рост. На МПБ – бульон прозрачный, на дне осадок в виде комочка ваты из переплетенных длинных цепочек палочек. На МПА – крупные шероховатые колонии с бахромчатыми краями. Под малым увеличением напоминают гриву льва, локоны волос, голову медузы Горгоны. На МПЖ – при посеве уколом рост в виде «перевернутой» елочки, так как микроб является аэробом. При необходимости выделенную культуру дифференцируют от почвенных спорообразующих бацилл, имеющих схожие морфологические и культуральные свойства. Это Bacillus anthracoides, Bac. pseudoanthracis и др, которые не патогенны. 3. Биопроба проводится путем заражения белых мышей эмульсией из материала в дозе 0,2 – 0,5 мл, подкожно, в области корня хвоста, кроликам 0,3 мл. Гибель наблюдается в течение 1 – 3-х суток. Из органов павших животных делают мазки и посев на питательные среды. 4. Серологический метод – РП, основан на обнаружении в материале сибиреязвенного антигена, образующегося при гибели и разрушении микробных клеток. При этом, из патологического материала или кожевенного сырья готовят экстракт (вытяжку) путем кипячения в течение 30 мин или настаивания в течение 16 – 18 ч. Если требуется срочный ответ, то путем кипячения. Полученный экстракт фильтруют и используют в качестве материала для обнаружения сибиреязвенного антигена. РП ставят методом наслаивания или подслаивания. Предварительный ответ ставят на основании микроскопии, окончательный – на основании выделения чистой культуры возбудителя и положительной биопробы. Срок исследования при положительном ответе до 3-х суток, при отрицательном – до 10 суток. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на сибирскую язву. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики. 3 Определите необходимость и порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте мазки-препараты (3 штуки) из биоматериала (толстый мазок крови), зафиксируйте их. 2 Окрасьте первый мазок-препарат по методу Грама. 3 Окрасьте второй мазок по Михину. 4 Окрасьте третий мазок по Пешкову или Златогорову. 5 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПБ. 2 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПА. 3 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПЖ. 4 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробной культуры и сделайте заключение о соответствии ее сибириязвенным бациллам Практическое задание 4: Проведите серологическое исследование кожевенно-мехового сырья на сибирскую язву. Этапы выполнения задания: 1 Подготовьте компоненты реакции преципитации к исследованию. 2 Поставьте реакцию преципитации (РП) по Асколи и проведите ее учет. 3 Зарисуйте результаты реакции в контрольной и опытной пробирках, обозначив компоненты реакции. Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при сибирской язве. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Какими морфологическими особенностями обладает возбудитель сибирской язвы. 2 Чем обусловлена высокая устойчивость возбудителя во внешней среде. 3 Назовите методы лабораторной диагностики сибирской язвы. 4 Какие лабораторные животные восприимчивы к возбудителю сибирской язвы? 5 Назовите биологические препараты, применяемые при сибирской язве. 6 При каких условиях и где возбудитель образует спору и капсулу? 7 На основании результатов каких исследований, устанавливают окончательный диагноз на сибирскую язву? 8 Какой биоматериал берут от трупа животного при подозрении на сибирскую язву? 9 В каком случае обязательно проводить исследование кожевенно-мехового сырья на сибирскую язву? План 1. Патологический материал для лабораторного исследования кишечных инфекций. 2. Бактериологические методы диагностики колибактериоза и сальмонеллеза. 3. Серологические методы типизации энтеробактерий. Материальное обеспечение: готовые мазки E. сoli, окрашенные по Граму, культуры E. сoli и Salmonella на агаре Эндо, МПА, МПБ, биопрепараты профилактические, лечебно-профилактические, диагностические, тампоны с 70 % спиртом, исследуемый биоматериал (фекалии), взвесь культуры E. сoli в пробирке, питательные среды Эндо, Левина, Симмонса, кровяной агар, агар с сернокислым железом, кюветы с «мостиком», дистиллированная вода, пипетки градуированные (1, 2 мл), бактериологическая петля, спиртовка, растворы красок (по Граму), физ. раствор. Таблицы (Схема исследования биоматериала на сальмонеллез. Серологическая классификация сальмонелл. Бактериологическая диагностика колисальмонеллезов. Дифференциация кишечных бактерий. Схема диагностики пуллороза-тифа птиц. Ферментативная активность представителей рода Эшерихия и Сальмонелла). Теоретический материал Диагностику колибактериоза определяют по клиническим, патологоанатомическим и эпизоотологическим данным, с обязательным подтверждением лабораторным исследованием. Бактериологическое исследование. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют патологический материал: для прижизненной диагностики – фекалии от больных животных, которые берут из прямой кишки в стеклянные пробирки стеклянной палочкой; для посмертной диагностики - свежий труп или трубчатую кость, отрезок кишечника перевязанного с двух концов, кусок печени, селезенки, почку, брыжеечные лимфоузлы. При вскрытии трупа в лаборатории помимо указанного материала исследуют также кровь из сердца и головной мозг. Если в лабораторию не представляется в кротчайший срок доставить материал. Его консервируют: фекалии - раствором стерильного глицерина с NaCl, кусочки внутренних органов в 30%-ном водном растворе глицерина или 10%-ном растворе NaCl. В лаборатории проводят комплексное исследование поступившего материала. При микроскопии мазков из органов и крови обнаруживают палочки с закругленными краями, расположенные одиночно, по Граму окрашиваются отрицательно. Для выделения культур эшерихий используют МПА, МПБ, а также среды специального назначения: Эндо, Левина, Симонса, Кларка и др. На МПА через 18…20ч вырастают влажные круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью. В жидкой среде рост эшерихий проявляется равномерным помутнением с образованием осадка. Некоторые штаммы обладают гемолитическими свойствами. На среде Эндо образует три типа колоний: 1) малиновые с металлическим блеском; 2) малиновые с розовым блеском; 3) розовые. На среде Левина дает рост в виде колоний темнофиолетового цвета. На среде Симсона не растут: цвет ее не изменяется. На среде Кларка: розово-красное окрашивание учитывают как положительный результат, желтое как отрицательный. Глюкозу и лактозу сбраживает с образованием кислоты и газа. Обесцвечивают метиленовую синь в молоке, молоко свертывает, образует индол. Реакция с метилротом положительная, проба Фогеса-Проскауэра отрицательная. Основываясь на морфологических и культурально - биохимических свойствах, проводят межвидовую дифференциацию. Выделенную культуру типируют в РА, используя типоспецифические агглютинирующие коли-сыворотки. Биопроба. Выделенные культуры проверяют на патогенность, заражая внутрибрюшинно белых мышей. Диагноз на колибактериоз считают установленным, если культуру возбудителя изолируют из селезенки, трубчатой кости или из головного мозга. Болезнь также подтверждается, если выделенная культура эшерихий из других органов вызывает гибель белых мышей. В большинстве случаев E.coli , выделенные из трупа или фекалий больных коли-инфекций животных, патогенны для мышей. Серологические исследования Кроме бактериологического исследования, диагноз устанавливают ускоренными методами. В этих целях применяют иммунохимический метод, путем постановки РДП или РИФ. При этом с помощью реакции иммунофлюоресценции можно ставить диагноз через 2-4 часа. Помимо общепринятого микробиологического исследования существуют также дополнительные методы диагностики. Например, люминесцентно-серологический метод используют как ориентировочный для определения патогенных серотипов E.coli при массовых вспышках желудочно-кишечных заболеваний. Этот метод позволяет за короткий срок получить предварительные результаты. Колибактериоз следует дифференцировать от диареи незаразного происхождения, сальмонеллеза, стрептококкоза, пастереллёза, некоторых вирусных инфекций. Бактериологическая прижизненная диагностика сальмонеллезов основана на исследовании крови в первые четыре дня заболевания (для выделения гемокультуры) и фекалий. Начиная с 14-го дня болезни, посылают сыворотку крови для серологического исследования и установления титра специфических антител. Посмертно в лабораторию направляют паренхиматозные органы или части их (печень с желчным пузырем), мезентеральные лимфатические узлы. Полученный материал засевают в МПБ, на МПА, дифференциальные и элективные среды – Эндо, Плоскирева или висмут-сульфитный агар. При подозрении на хроническое течение болезни дополнительно высевают материал на одну из сред накопления (селенитовую, Мюллера). При подтверждении диагноза тушки истощенных птиц, а также внутренние органы, имеющие патологоанатомические изменения, направляют на утилизацию. При поражении только внутренних органов тушки используют после проваривания для переработки на консервы, а внутренние органы утилизируют. Перо и пух дезинфицируют. Яйца от неблагополучных по сальмонеллезу кур, индеек направляют на пищевые предприятия для приготовления хлебобулочных, кондитерских изделий, выпекаемых при высокой температуре. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на сальмонеллез и колибактериоз (эшерихиоз). Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического исследования. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики. 3 Определите порядок серологического типирования выделенных из биоматериала микробных культур. 4 Схемы исследований зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте мазки-препараты из смыва агаровой культуры E. сoli, зафиксируйте их. 2 Окрасьте мазки-препараты по методу Грама. 3 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробных культур. Этапы выполнения задания: 1 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПБ. 2 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПА. 3 Опишите характер роста микробной культуры на дифференциальных средах. 4 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробной культуры и сделайте заключение о соответствии ее сальмонеллам или кишечной палочки. Практическое задание 4: Проведите типизацию микробной культуры. Этапы выполнения задания: 1 Проведите учет сахаролитических свойств микробных культур. 2 Проведите учет протеолитических свойств микробных культур. 3 Анализируйте полученные результаты, определите вид микроорганизма, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 5: Проведите посев фекалий на дифференциально-диагностическую среду. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте взвесь фекалий животных, оставьте их отстояться. 2 Проведите посев надосадочной жидкости фекальной взвеси бактериологической петлей частыми штрихами на агар Эндо. 3 На следующем занятии проведите учет и оценку роста микроорганизмов на агаре Эндо, отчитайтесь преподавателю, пояснив, что дает посев штрихом. Практическое задание 6: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при кишечных инфекциях. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Перечислите патологический материал, направляемый для бактериологического исследования на эшерихиоз, и требования к нему. 2 Назовите питательные среды, используемые для выделения и дифференциации кишечной палочки. 3 Поясните порядок бактериологического исследования различных видов биоматериала на наличие возбудителя эшерихиоза. 4, Каково практическое использование знаний об антигенной структуре кишечной палочки? 5 В чем заключается серологическая типизация энтеропатогенных штаммов эшерихий по адгезивным и соматическим О-антигенам. 6 По каким признакам дифференцируют кишечную палочку от сальмонелл? 7 Какими штаммами кишечной палочки вызывается отечная болезнь поросят? 8 В каких случаях считается установленным бактериологический диагноз на колибактериоз? 9 Дайте характеристику биопрепаратам, применяемым для диагностики, лечения и профилактики колибактериоза (эшерихиозов) и сальмонеллезов. 10 Какой биоматериал направляют для бактериологического исследования на сальмонеллез? 11 Какие питательные среды используют для выделения и дифференциации сальмонелл? 12 Поясните порядок бактериологического исследования различных видов биоматериала на наличие сальмонелл. 13 Какова антигенная структура сальмонелл, её практическое использование? 14 Каким методом определяют серогруппу сальмонелл? 15 По каким признакам дифференцируют сальмонеллы от эшерихий? План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Методы диагностики анаэробных инфекций животных. 3. Дифференциация возбудителей клостридиозов. Материальное обеспечение: микроскоп, микроанаэростат, питательные среды МППБ, Китта-Тароцци, среда Вильсона-Блера, готовые фиксированные мазки-препараты микробных культур Cl. tetani, Cl. botulinus, F.necroforum и др. Таблицы (Морфология анаэробов, Схема бактериологического исследования на анаэробные инфекции). Теоретический материал К роду Clostridium относятся подвижные палочки (реже неподвижные); образуют овальные или круглые эндоспоры, придающие клеткам веретенообразную форму (от гр. kloster - веретено). С возрастом могут изменять отношение к окрашиванию по Граму, но на ранних стадиях культивирования всегда грамположительны. Хемоорганотрофы; одни виды проявляют сахаролитическую, другие - протеолитическую активность (возможно сочетание этих свойств либо их полное отсутствие). Наиболее характерные признаки - способность вызывать масляно-кислое брожение и анаэробный распад углеводов с образованием масляной кислоты и газов (СО2, водород, иногда метан). Восстанавливают сульфиты до сульфидов Большинство видов - строгие анаэробы; также имеются аэротолерантные виды или отдельные штаммы. Род включает виды, обитающие в почве, на дне пресных и солёных водоёмов, в кишечнике человека и животных; некоторые виды патогенны, а некоторые нашли применение в промышленном производстве некоторых органических кислот и спиртов. Современная систематика выделяет 5 групп микроорганизмов, разделяемых по расположению спор, способности гидролизовать желатин и особым требованиям для роста. По экологическим свойствам выделяют 3 группы клостридий: возбудители бродильных процессов (с преобладанием сахаролитических свойств); возбудители процессов гниения (с преобладанием протеолитических свойств); патогенные виды (могут быть протеолитическими и сахаролитическими). Последнюю группу составляют возбудители травматических клостридиозов (газовой гангрены, столбняка); возбудители энтеральных клостридиозов и непатогенные виды вызывающие патологические процессы в ассоциациях с другими патогенными клостридиям. Клостридиозы, как правило, имеют экзогенное происхождение. План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Бактериологические методы диагностики туберкулеза. 3. Аллергическая диагностика туберкулеза. Материальное обеспечение: пробы биоматериала (лимф. узел, молоко, вода, почва), стерильная ступка с пестиком, градуированные пипетки стерильные емкостью1 и 2 мл, пробирка со стерильным песком, пробирка стерильная центрифужная, весы для уравновешивания пробирок, спиртовка, набор растворов красителей для окрашивания по методу Циля-Нильсена, кювета с «мостиком», вода дистиллированная, биопрепараты (туберкулин ППД для млекопитающих и птиц, вакцина из штамма БЦЖ), стерилизатор со стерильными инструментами, бикс с марлевыми повязками, колба с физ. раствором, колба с 3%-ным раствором серной кислоты, готовые мазки микобактерий, окрашенные по Цилю-Нильсену, предметные стекла. среда Левенштейна-Йенсена в пробирках и флаконе, спиртовые тампоны, марлевые повязки. Таблицы (Морфология микобактерий (окраска по Цилю- Нильсену); Схема лабораторной диагностики туберкулеза). Теоретический материал Туберкулез – хронически протекающая инфекционная болезнь многих видов сельскохозяйственных, диких животных, в том числе птиц, а также человека. Патолого-анатомически болезнь характеризуется образованием в органах и тканях туберкул, склонных к творожистому распаду. Возбудитель: Myc. tuberculosis - человека, Myc. bovis – крупного рогатого скота, Myc. avium – птиц. Диагностика туберкулеза подразделяется на прижизненную и посмертную. Диагноз на туберкулез устанавливают комплексно, применяют клинический, патолого-анатомический, гистологический, аллергический и лабораторные методы. Разработаны методики и современных методов диагностики туберкулеза ДНК-ДНК гибридизация и ПЦР. Первичный диагноз на туберкулез установить сложно. У человека применяют флюорографию. У животных основным прижизненным методом массовой диагностики служит аллергический. Лабораторная диагностика. Выделить возбудителя туберкулеза в чистом виде трудно. Успех во многом зависит от характера исследуемого материала. В качестве последнего можно использовать пораженные органы и ткани, гной, молоко, масло, творог, мочу, фекалии, навоз, почву, воду, соскобы с различных объектов животноводческих помещений и т.п. В каждом случае перед посевом необходимо выбирать соответствующий метод обработки исследуемого материала. Для освобождения от посторонней микрофлоры исследуемый материал (молоко, мочу, слизь, пораженные органы и ткани) обрабатывают 6-10%-ным раствором серной кислоты (метод Гона). Общее воздействие раствора серной кислоты на материал не должно превышать 25-30 мин. Для обработки жидкого, полужидкого материала и соскобов с объектов среды обитания животных используют метод флотации. Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал взбалтывают в колбе с углеводородами (бензол, бензин и др.) и всплывающий слой пены, то есть флотат, содержащий микобактерии туберкулеза, используют для приготовления мазков, посевов на питательные среды, заражения лабораторных животных. При убое животных, положительно реагирующих на туберкулин, и отсутствии патологоанатомических изменений в лимфатических узлах, тканях и органах туберкулезного характера, туши выпускают без ограничений, шкуры – без дезинфекции. Молоко от коров неблагополучных по туберкулезу, обезвреживают в хозяйстве при 900С в течение 5 мин или при 850С в течение 30 мин, после чего отправляют на молокозавод, где его подвергают повторной пастеризации при обычном режиме. Запрещается продажа молока и молочных продуктов на рынке из неблагополучных по туберкулезу хозяйств и от клинически больных и положительно реагирующих на туберкулез животных частного сектора. Полностью туша и все другие продукты убоя направляются на утилизацию в двух случаях: первый – когда туши имеют тощую упитанность, любую форму поражения туберкулезом органов или лимфатических узлов, второй - при обнаружении генерализованного туберкулезного процесса независимо от упитанности. Аллергическая диагностика туберкулеза. В практике ведущее значение для прижизненного распознавания туберкулеза у животных и птиц имеет аллергическая диагностика при помощи туберкулина (Р.Кох, 1890). Следует указать, что еще до сообщения Коха в России Гельман в 1888-1889 гг. изготовил экстракт из туберкулезных бактерий и испытал его с диагностической целью на больных туберкулезом коровах, получив при этом положительный результат. Диагностика с помощью туберкулина завоевала прочное положение в медицине и ветеринарии. В настоящее время основным методом проверки животных на туберкулез является внутрикожная туберкулиновая проба. Для изготовления туберкулинов для млекопитающих используют штаммы только одного бычьего вида. Применяют сухой очищенный туберкулин (протеин-пурифиед-дериват – ППД) или раствор туберкулина. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования патологического материала на туберкулез. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического исследования. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики. 3 Определите необходимость и порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Подготовьте представленный биоматериал (лимф. узлы, молоко, вода, почва) к бактериологическому исследованию. 1 Измельчите биоматериал в ступке, разотрите его со стерильным песком. 2 Залейте 3%-ным раствором серной кислоты на 15-20 минут. 3 Удалите кислоту с помощью пипетки, отмойте материал стерильным физиологическим раствором. 4 Перенесите материал в центрифужные пробирки и центрифугируйте. 5 Повторите обработку физиологическим раствором 2-3 раза. Полученный осадок используйте для посева и микроскопического исследования. Практическое задание 3: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробной культуры, обнаруженной в мазках. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте мазки-отпечатки из лимфатических узлов и мазок из осадка (центрифугата), зафиксируйте их. 2 Окрасьте мазки по методу Циля-Нильсена. 3 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 4: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при туберкулезе. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Назовите морфологические и тинкториальные особенности М.bovis, M. tuberculosis, M. avium. 2 Какие питательные среды применяют для культивирования микобактерий? 3 Назовите отличительные особенности культуральных свойств видов микобактерий. 4 Как проводят идентификацию видов микобактерий туберкулеза при лабораторной диагностике? 5 В чем заключаются особенности биопробы при диагностике туберкулеза? 6 Какой биологический материал используют при бактериологическом исследовании на туберкулез? 7 С какой целью обрабатывают патологический материал слабыми растворами кислот перед исследованием? 8 Какие правила асептики и личной профилактики необходимо выполнять при работе с биоматериалом, инфицированным патогенными микобактериями? 10 Как проводят прижизненную диагностику туберкулеза у животных? План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Бактериологические методы диагностики бруцеллеза. 3. Серологическая диагностика бруцеллеза. 4. Аллергическая диагностика бруцеллеза. Материальное обеспечение: пробы сыворотки крови крупного рогатого скота, позитивная и негативная (изготовленные на биофабрике), пробы молока по 2 мл, бруцеллезный антиген для розбенгал пробы, антиген бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, единый бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК, пластины для постановки розбенгал пробы, гемолизин, культура бруцелл (вакцинный штамм) на агаре, микроскопические препараты – мазки, окрашенные по методам Козловского и Грама, биопрепараты диагностические, вакцины шт. 19, 82, Рев – 1. Готовые результаты РА и РСК, предметные стекла, пастеровские пипетки стерильные, тампоны с 70% спиртом, микроскоп, растворы красителей для окраски по методам Козловского и Грама, пробирки; пипетки градуированные, стерильные емкостью 1 и 0,1 мл; единый бруцеллезный антиген, спиртовка, кювета с “мостиком”, вода дистиллированная. Таблицы (Мофология бруцелл; Схема лабораторной диагностики бруцеллеза; Дифференциация видов бруцелл; Схема постановки РА; Схема постановки РСК). Теоретический материал Бруцеллез — хроническая инфекционная болезнь животных и человека, проявляющаяся абортами, эндометритами, задержанием последа, орхитами, рецидивирующей лихорадкой, у лошадей — преимущественно бурситами в области холки и воспалением связок затылочного сустава. В. ovis вызывает эпидидимит у баранов, яловость, аборты и рождение нежизнеспособных ягнят. Возбудитель относится к роду Brucella, который включает 6 видов: В. abortus —возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота; В. melitensis —овец и коз; В. suis — свиней; В. canis—собак; В. neotomae— кустарниковых крыс; В. ovis — инфекционного эпидидимита баранов. Лабораторные методы диагностики – бактериологический и серологический. В лабораторию направляют абортированный плод с плодными оболочками или желудок плода с содержимым, кусочки печени, селезенки, содержимое гигром, абсцессов, молоко; от убитых животных — лимфоузлы, кусочки паренхиматозных органов, костный мозг, матку, яичники, семенники, вымя; от баранов—семенники с придатками. На серологическое исследование направляют кровь или сыворотку крови и молоко. Бактериоскопия. Мазки фиксируют на пламени, окрашивают по Граму и Козловскому. При микроскопии учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные бактерии, окрашивающиеся по Козловскому в красный цвет. Бактериологическое исследование. Посевы из патологического материала производят на ПГГБ, ПГГА, МППБ, МППГГА, картофельный агар. С целью подавления посторонней микрофлоры в среды можно добавлять гепцианвиолет (1:200000) или кристаллвиолет (1:100000). При исследовании материала от крупного рогатого скота одну часть посевов инкубируют в атмосфере с содержанием 10-15% СО2. Выделение культур В. ovis проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-амино-пептидном агарах в атмосфере с 10-15% СО2. Посевы помещают при температуре 37-38°С и инкубируют 30 дней. Культуры бактерий, обладающие типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, дающие положительную РА с позитивной сывороткой, относят к бруцеллам. Виды бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствие повышенной концентрации СО2, выделению НS2, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей и агглютинации моноспецифическими сыворотками. Таблица 17 – Дифференциация видов бруцелл
Биопроба. Проводят ее на морских свинках (не менее двух), сыворотка которых в разведении 1:5 отрицательно реагирует в РА с бруцеллезным антигеном. На 15, 25 и 40-й день после заражения берут кровь и сыворотку, исследуют в пробирочной РА в титрах от 1:10 до 1:80. Результат на бруцеллез считается положительным, если сыворотка реагирует в титре 1:10 и выше. Для выделения культуры свинок убивают и делают посевы из лимфоузлов, селезенки, печени и костного мозга. Серологические методы. Для диагностики бруцеллеза животных применяют реакцию агглютинации в пробирках (РА), реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), пластинчатую реакцию агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба, РБП) и кольцевую реакцию с молоком (КР). РА ставят в объеме 1 мл с единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК. Сыворотки крови овец, коз, буйволов, оленей и собак исследуют в разведениях 1:25, 1:50, 1:100, 1:200; крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов—1:50, 1:100, 1:200 и 1:400. РА считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов, начиная с разведения 1:100 (100 ME); овец, коз, буйволов, оленей и собак—с 1:50 (50 ME) с оценкой не менее чем на 2 плюса. Сомнительной — при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и 1:25 (25 ME)—с сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 плюса. РСК— специфический и высокочувствительный метод диагностики бруцеллеза животных. Ее показания более постоянны и длительней сохраняются: комплементсвязывающие антитела появляются позже, чем агглютинины. Эта реакция позволяет выявить большее количество больных в стадах с давней инфекцией. РСК применяют при диагностике бруцеллеза у вышеперечисленных животных, а также свиней. РДСК - более чувствительный тест, чем РСК - при инфекционном эпидидимите баранов используют только РДСК с овисным антигеном. РСК и РДСК считают положительными при задержке гемолиза на 2-4 плюса в одном или двух разведениях (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена). Сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один плюс. РБП используют для исследования сывороток крови крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и оленей. Реакцию ставят при температуре 18 - 2О°С с бруцеллезным антигеном, окрашенным бенгальским розовым, на пластинках с лунками. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета. КР ставят с цельным свежим или консервированным формалином молоком коров и антигеном — взвесью убитых бруцелл, окрашенных в синий цвет гематоксилином. При наличии в молоке специфических антител происходит агрегация антигена, образовавшийся комплекс адсорбируется сливками молока и поднимается с ними вверх, образуя четкое, окрашенное кольцо. Проводится реакция в уленгутовских пробирках, в которые вносят по 0,05 мл антигена, добавляют 1 мл молока, и содержимое тщательно смешивают. Реакция проходит при температуре 37—38 °С в течение 1 ч. Результаты учитывают визуально и оценивают в плюсах: «+ ++»— четко выраженное синее кольцо в верхней части молока, остальная часть молока белая, «++» — достаточно выраженное синее кольцо, столбик молока синеватого цвета. Пробы, давшие реакцию с оценкой 3 и 2 плюса, считают положительными. Эту реакцию рекомендуют для проверки благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота и молока на рынках. Для выявления бруцелл непосредственно в патологическом материале, а также в объектах внешней среды предложен прямой метод иммунофлюоресценции (РИФ), непрямой же метод позволяет обнаружить антитела в сыворотке крови больных, переболевших или привитых животных. Аллергический метод. Для аллергической диагностики бруцеллеза овец, коз и свиней используют бруцеллин ВИЭВ, изготовляемый из неагглютиногенного и авирулентного штамма В. abortus В-1. У овец и коз применяют пальцебралыную пробу, свиньям препарат вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины. У животных, больных бруцеллезом, на месте введения бруцеллина развивается воспалительная реакция. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на бруцеллез. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики. 3 Определите порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства вакцинного штамма бруцелл. Этапы выполнения задания: 1 Окрасьте фиксированные мазки-препараты по методам Грама и Козловского. 2 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Исследуйте пробу молока на бруцеллез кольцевой реакцией. Этапы выполнения задания: 1 Внесите необходимое количество молока в пробирку. 2 Внесите бруцеллезный антиген для КР, перемешайте содержимое пробирок и поместите пробирки в термостат. 3 Проведите учет и оценку результатов КР, сделайте заключение. Практическое задание 4: Проведите серологическое исследование сыворотки крови животных на бруцеллез РБП. Этапы выполнения задания: 1 Нанесите две капли сыворотки (контрольную и опытную) на пластину. 2 Внесите антиген для РБП в каждую каплю, проведите визуальный учет реакции. 3 Зарисуйте результаты реакции в контрольной и опытной пробах. Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при бруцеллезе. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните правила и технику отбора патологического материала для серологической и бактериологической диагностики бруцеллеза. 2 Поясните порядок диагностических исследований на бруцеллез животных в лаборатории. 3 Какие методы бактериологического исследования биоматериала на бруцеллез применяют в лаборатории, в чем их сущность? 4 Каким методом определяют патогенность бруцелл? 5 В чем особенности проведения биопробы при лабораторной диагностике бруцеллеза? 6 Назовите методы серологической диагностики бруцеллеза. 7 Какое практическое значение имеет кольцевая реакция с молоком? 8 С какой целью применяют РБП? 9 Какими культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами обладают бруцеллы? 10 В чем сущность серологической диагностики бруцеллеза? План 1. Патологический материал для лабораторного исследования. 2. Бактериологические методы диагностики сибирской язвы. 3. Серологические методы диагностики сибирской язвы. Материальное обеспечение: предметные и покровные стекла, пипетки, резиновая груша, спиртовка, микроскоп с темнопольным конденсором и осветителем ОН-17, пластины из плексигласа с луночками, физиологический раствор, четыре пробирки, ножницы, антиген для диагностики лептоспироза, сыворотка, высушенная на фильтровальной бумаге, культура лептоспир. Таблицы (Морфология лептоспир. Формы колоний, Схема бактериального исследования. Биопрепараты). Теоретический материал Материалом для исследования на лептоспироз служат: кровь (лучше брать на 3-5-й день болезни при повышенной температуре тела), моча, кусочки паренхиматозных органов, почка, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод. Патологический материал отбирается не позже 2 часов после гибели животного. Моча собирается при естественном мочеиспускании и в летнее время исследуется в течение 3 часов. Микроскопия. Исследуют мочу, цитратную кровь, тканевую суспензию. Микроскопию проводят в раздавленной капле с конденсором «темного поля». Типичные лептоспиры подвижны и имеют форму прямой или S-образно изогнутой серебристо-белой нити с загнутыми в виде крючков концами. Лептоспиры также можно обнаружить в срезах из органов после импрегнации серебром по методу Левадити. Выделение культур. Материал засевают по 1-3 капли одновременно в 3-5 пробирок со специальной питательной средой и инкубируют при температуре 28-300С в течение 3 мес. Лептоспиры начинают размножаться через 7-20 дней, иногда 1-2 и очень редко – 3 мес. Наличие роста контролируют темнопольной микроскопией раздавленных капель, которые готовят через каждые 5 дней из всех пробирок. При обнаружении размножения лептоспир делают пересев в 3-5 пробирок со свежей средой. Получить культуры лептоспир удается не всегда. Биологическая проба. Метод более эффективный, чем бактериологический; проводится с целью выделения и очистки культур лептоспир, определения вирулентности и дифференциации от сапрофитов. Серологическое исследование. Для серологической диагностики лептоспироза используют РМА (реакция микроагглютинации) и реакцию агглютинации (РА). Пробы крови берут на 5-7-й день болезни и при исследовании отдельных животных повторно через 7-10 дней. Необходимо помнить, что антитела в крови у выздоровевших животных могут сохраняться до двух и более лет. Реакция микроагглютинации (РМА) является высокоспецифичной, доступной, не требует дорогостоящего оборудования и больших затрат времени. Впервые серологическую диагностику лептоспироза у людей предложили Мартен и Пети в 1919г. Метод исследования ими был назван реакция агглютинации, в последующие годы называли – реакция микроагглютинации и лизиса (РМА и Л), в настоящее время принято название реакция микроагглютинации (РМА). РМА нашла широкое применение и в ветеринарной практике. В разные годы учёными были предложены модификации серологического исследования (РМА) на лептоспироз: для собак – Уленгут и Циммерман (1936 г.); для крупного рогатого скота – Терских, Земсков (1939г.), Романенко, Любашенко (1940г.), Ляпустин (1945г.); для овец и коз – Терских, Газарян, Саркисян (1942г.), Ляпустин, Варфоломеева (1945г.); для свиней – Терских(1940г.) и др. Сущность реакции и цель применения. В основе реакции микроагглютинации (РМА) лежит специфическое взаимодействие между антигенами (живые культуры лептоспир) и антителами. РМА применяют с целью обнаружения в сыворотке крови животных антител, специфичных возбудителю лептоспироза, и определения их количества (титра). Материалы исследований. Для исследования используют свежую, замороженную, высушенную на фильтровальной бумаге, консервированную фенолом или борной кислотой сыворотку крови. Кровь для серологического исследования берут в количестве 5-10 см³ не ранее чем через 5-7 суток после проявления клинических признаков болезни или через 90 суток – для крупного рогатого скота, 60 суток – для свиней и животных других видов после введения вакцины. Компоненты реакции и подготовка материала к исследованию. В РМА участвуют сыворотка крови животных и культуры лептоспир. Нативные сыворотки проверяют (гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют). Замороженные сыворотки оттаивают при комнатной температуре. Повторное замораживание сывороток не допускается. Сыворотки разбавляют физиологическим раствором невакцинированных животных в соотношении 1:25; вакцинированных животных – 1:50. После добавления антигена разведения удваиваются и составляют соответственно 1:50 и 1:100. При необходимости сыворотку разбавляют в соотношениях 1:100; 1:200; 1:400 и т.д. Консервация сыворотки крови методом высушивания. На квадраты белой фильтровальной бумаги (5х5см) наносят по 3-5 капель (0,05 см³ каждая капля) сыворотки. Высушивание проводят при комнатной температуре. Высушенные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. При исследовании сыворотки, высушенной на фильтровальной бумаге, вырезают одну или две капли (0,05 или 0,1 см³) сыворотки, измельчают ножницами и заливают в пробирки с физиологическим раствором в объёме 2,45 или 4,9 см³, соответственно, экстрагируют в течение одного часа при температуре 37±1°С. Полученный экстракт используют как исходное разведение сыворотки 1:25 или 1:50. Сыворотку крови животных при ввозе их в хозяйство и вывозе из него для племенных целей и целей воспроизводства разводят 1:25 и исследуют только в одном разведении (после добавления антигена разведение сыворотки будет соответствовать 1:50). При изучении этиологической структуры и обследовании импортируемого скота реакцию ставят со всеми приведенными в таблице антигенами, при обследовании животных в хозяйствах с известной этиологией и при перевозке внутри страны реакцию ставят с антигенами 4-7 серогрупп (Pomona, Tarassovi, Canicola, Hebdomadis, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorragiae). Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всероссийском государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов не реже одного раза в год. В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5-15 суток без признаков агглютинации и лизиса. Через каждые три месяца лаборатории контролируют диагностические штаммы лептоспир в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми агглютинирующими сыворотками. Порядок постановки реакции. Разведенную сыворотку разливают мерной пипеткой или аппаратом Флоринского, начиная с большего разведения, в лунки агглютинационных пластин или пробирки по 0,1 см³ в каждую. Сыворотку из каждого разведения разливают в отдельный ряд, состоящий из 4-23 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 см³ в 1-3 лунки в зависимости от количества разведений сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при 30-37°С в течение часа. Контрольной служит смесь 0,1 см³ культуры лептоспир с 0,1см³ физиологического раствора. Лептоспиры в контрольном варианте должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации. Учет и оценка реакции. Реакцию, учитывают микроскопией капель из каждой лунки в тёмном поле микроскопа при увеличении 20х10 или 40х7х1,5. Капли из лунок наносят на предметное стекло бактериологической петлёй из большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли наносят двумя способами: - бактериологической петлёй диаметром 3 мм. Наносят на стекло сразу до 30 капель и просматривают их под микроскопом; - бактериологической петлёй диаметром 1мм. Наносят на предметное стекло в освещённый центр поля зрения одну каплю и просматривают её, передвигая столик на 2-3 мм, и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. Перед взятием каждого нового антигена петлю прокаливают и охлаждают. Результаты реакции оценивают в крестах: ++++ (#) агглютинированы 100 % лептоспир; +++ агглютинированы 75 % лептоспир; ++ агглютинированы 50 % лептоспир; + агглютинированы 25 % лептоспир; - агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3-5 до нескольких десятков и сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность. В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоспир, проявляющийся в набухании и прекращении движения клеток, появлении зернистости и полного распада микробных клеток. Положительной считают РМА, с оценкой в два креста и более при отсутствии агглютинации в контроле. Наличие специфических антител в сыворотке крови животных в титре 1:50 и выше невакцинированных, и 1:100 и выше у вакцинированных свидетельствуют об инфицировании данной особи лептоспирами и, возможно, лептоспироносительстве. По результатам реакции микроагглютинации возбудителями лептоспироза считают лептоспиры той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на лептоспироз. Этапы выполнения задания: 1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований. Обоснуйте выбор материала при жизни и после гибели животного. 2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики. 3 Определите порядок выполнения серологического исследования биоматериалов. 4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь. Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства культуры лептоспир. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте препарат для темнопольной микроскопии из бульонной культуры. 2 Микроскопируйте препарат, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробных культур. Этапы выполнения задания: 1 Опишите рост лептоспир в жидких средах. 2 Опишите рост лептоспир в плотных средах. 3 Поясните особенности роста лептоспир в питательных средах, сделайте заключение. Практическое задание 4: Проведите серологическое исследование сыворотки крови животных на лептоспироз РМА. Этапы выполнения задания: 1 Подготовьте сыворотку крови, высушенную на фильтровальной бумаге к исследованию. 2 Внесите сыворотку из каждого разведения в необходимом количестве в лунки пластигласовых пластин и добавьте антиген. 3 Поставьте необходимые контроли. 4 Проведите учет и оценку реакции микроскопическим методом. 3 Зарисуйте результаты реакции в контрольной и опытной пробах, посните результаты преподавателю. Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при лептоспирозе. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните правила взятия и подготовки материала для бактериологической диагностики лептоспироза. 2 Какой вид микроскопии применяют при исследовании мочи животных на лептоспироз? 3 В чем сущность серологической диагностики лептоспироза с помощью РМА? 4 Почему реакция называется микроагглютинации? 5 В чем заключаются отличительные особенности течения лептоспироза у свиней и других с.-х. животных? 6 Какими биологическими свойствами обладает возбудитель лептоспироза? 7 Назовите возбудитель лептоспироза. 8 Сколько серологических групп возбудителя лептоспироза известно? 9 Поясните порядок культивирования лептоспир в лаборатории. 10 Какие биопрепараты применяют при лептоспирозе? План 1. Патологический материал и порядок его подготовки для лабораторного исследования. 2. Лабораторные методы диагностики трихофитии, микроспории, фавуса. Материальное обеспечение: культуры грибов на агаре Сабуро, вакцины, биоматериал (пораженные волосы от животных, больных трихофитией и микроспорией), препаровальные иглы, предметные стекла, чашки Петри, пинцеты, 20 % р-р NaOH, 50 % раствор водного глицерина, микроскоп, предметные стекла, бактериологические петли, карандаш по стеклу, спиртовки, спички, тампоны с 70 % -ным спиртом, препаровальные иглы, чашки Петри, пинцеты. Таблицы (Волосы, пораженные возбудителем трихофитии и микроспории. Трихофития у человека. Трихофития у теленка). Теоретический материал Взятие и пересылка материала при микозах Стригущий лишай, парша. Для исследования берут чешуйки или корочки с периферии пораженного участка, не подвергавшегося лечению. Патологический материал пересылают в чистой закрытой стеклянной посуде (пробирки, флаконы из-под антибиотиков). Кандидамикоз (молочница). Для прижизненной диагностики кандидамикоза в лабораторию направляют в стерильных пробирках соскобы из пораженных участков слизистой оболочки ротовой полости. При подозрении на кандидамикоз птиц в лабораторию лучше направить больную птицу. При массовых заболеваниях коров маститами молоко стерильно сдаивают из пораженных долей вымени в стерильные пробирки, которые с нарочным срочно направляют в лабораторию. Перед взятием проб молока соски вымени тщательно протирают тампоном, смоченным в разведенном (60%-ном) спирте. Первую порцию молока, находящегося в канале соска, сдаивают. Для посмертной диагностики в лабораторию направляют части различных пораженных органов или свежие трупы птиц. Для гистологического исследования материал консервируют 10%-ным водным раствором формалина. Эпизоотический лимфангоит. Для лабораторной диагностики посылают: стерильно собранный гной из невскрывшихся абсцессов (в пробирке или пастеровской пинетке); соскобы с поверхности язв (в пробирке); тонкие высушенные на воздухе мазки из гноя (на предметных стеклах). Аспергиллез. При подозрении на аспергиллез у павших или вынужденно убитых животных берут измененные с гранулематозньщ процессом участки легких и других органов в стерильные банки с притертой пробкой. Трупы птиц направляют в лабораторию в водонепроницаемой таре. Дерматомикозы – заболевания кожи, вызываемые патогенными грибами – дерматофитами. Грибковые заболевания кожи делятся на 5 групп. Кератомикозы – эпикутанные микозы. Возбудители этих микозов поражают самые поверхностные части рогового слоя кожи или кутикулу волоса, не затрагивая его медулярного вещества, не вызывая воспалительной реакции дермы. Лабораторная диагностика этих микозов заключается в выявлении тканевых форм возбудителей с помощью микроскопии неокрашенных препаратов волос и кожных чешуек. Выделение возбудителей на питательных средах не является обязательным. 1. Дерматомикозы подразделяются на эпидермофитию, трихофитию, микроспорию, фавус – наиболее распространенные и контагиозные грибковые инфекции. Возбудители эпидермофитии поражают всю толщу рогового слоя кожи, нередко ногтевые пластинки, вызывают воспалительную реакцию со стороны нижележащих слоев кожи, но иногда не поражают волосы. Возбудители трихофитии, паразитируя в роговом слое кожи. Вызывают воспалительную реакцию нижележащих её слоев, иногда нагноение. Поражают волосы, прорастая в их кутикулу и внедряясь в корковое и медулярное вещество волоса. 2. Кандидомикозы кожи и слизистых оболочек наиболее часто вызываются дрожжеподобными грибами рода Candida. Чаще поражаются крупные и мелкие складки кожи, слизистые оболочки урогенитальных путей, полости рта, иногда тонкие ногти и ногтевые валики, углы рта. 3. Глубокие микозы – бластомикозы, гистоплазмоз, висцеральные кандидомикозы, висцеральные плесневые микозы (пенициллиоз, аспергиллез, мукороз). Возбудители поражают кожу, подкожную клетчатку, мышцы, внутренние органы, вызывая воспалительную реакцию грануломатозного характера, могут распространяться по лимфатическим и кровеносным сосудам. 4. Отдельно выделяют псевдомикозы, которые хотя и не являются грибковыми заболеваниями, но по сходству клинических проявлений с истинными микозами нуждаются во взаимной дифференциальной диагностике. К псевдомикозам относят актиномикоз и нокардиоз – хронические гранулематозные гнойно-фистулезные, а так же узловато-язвенные поражения кожи, легких, кишечника и других органов. Существуют много различных кожных заболеваний, напоминающих по своей клинической картине грибковые поражения кожи, поэтому лабораторные исследования играют большую, нередко решающую роль в диагностике дерматомикозов. Каждый случай грибкового заболевания требует лабораторного подтверждения. Особенно велико значение лабораторных исследований при висцеральных грибковых заболеваниях, при которых клиническая картина похожа на другие заболевания внутренних органов. Этапы лабораторной диагностики микозов: 1. Обнаружение возбудителя в патологическом материале (микроскопическое исследование нативных или окрашенных препаратов). 2. Выделение возбудителя в культуре (посевы на питательные среды). 3. Идентификация возбудителя. 4. Изучение ответной реакции макроорганизмов по серологическим, иммунологическим реакциям, проведение кожных аллергических проб и др. Иногда проводится гистологическое исследование и экспериментальное заражение животных. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Проведите исследование волос животных на дерматомикозы. Этапы выполнения задания: 1 Подготовьте пораженные волосы к микроскопическому исследованию. 2 Приготовьте мазки-препараты методом раздавленной капли из биоматериала. 3 Микроскопируйте и зарисуйте в тетрадь результаты исследования. Сделайте заключение, поставьте диагноз. Практическое задание 2: Определите морфологические свойства микробной культуры грибов, выращенных на специальных средах. Этапы выполнения задания: 1 Приготовьте препараты «висячая» или «раздавленная» капля, микроскопируйте при малом или среднем увеличеснии микроскопа. 2 Зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, определите род гриба, отчитайтесь преподавателю. Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробной культуры грибов. Этапы выполнения задания: 1 Проведите посев биоматериала на среду Сабуро. 2 На следующем занятии опишите характер роста микробной культуры на среде Сабуро. 3 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробной культуры и сделайте заключение по классификации грибов. Практическое задание 4: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при микозах. Этапы выполнения задания: 1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения. 2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату. 3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Назовите основные отличия микозов и микотоксикозов. 2 В чем отличие разных родов дерматомицетов? 3 Какой патологический материал берут при подозрении на стригущий лишай? 4 Какие болезни называют стригущий лишай? 5 Поясните технику проведения микроскопического исследований на дерматомикозы. 6 Как располагаются споры трихофитона и микроспорума в пораженном волосе? 7 Как можно дифференцировать трихофитию и микроспорию? 8 опишите клинические признаки микроспории. 9 Какие болезни животных называют микозами и почему? 10 Назовите возбудителей кандидамикоза, аспергиллеза. 11 Какими свойствами обладают грибы рода Candida? План 1. Микробиологические методы санитарной оценки питьевой воды. 2. Методы санитарной оценки воздуха в в закрытых помещениях. Материальное обеспечение: пробы воды из различных источников, стерильная лабораторная посуда (чашки Петри, пипетки), стерильные питательные среды для исследования воздуха (МПА, агар Эндо, агар Сабуро, солевой агар), питательные среды для исследования воды (МПА, ЛПС, ЖСС), набор инструментов для посева, спиртовки, спички. Теоретический материал Санитарную оценку воздуха проводят путем определения: 1 общего микробного числа в 1 см3 (МПА в чашках Петри); 2 количества гемолитических и зеленящих стрептококков (на кровяном агаре); 3 спор микроскопических грибов и дрожжей ( агар Сабуро) – на предприятиях мясомолочной промышленности; 4 санитарно-показательных микроорганизмов (на кровяном агаре); 5 патогенных стафилококков (на желточно-солевом или солевом агаре). Методы исследования воздуха. 1 Седиментационный. Чашки Петри со стерильными средами оставляют открытыми на 5-10 минут, закрывают и культивируют в термостате, соответственно, при 22˚С – 5 суток, при 30˚С – 48 часов. Подсчитывают все выросшие колонии и определяют общее микробное число по формуле: Х =
a – число колоний; b – количество чашек T – время экспозиции. По Омелянскому установлено, что на площадь чашки 100 см2 оседает за 5 минут такое количество микроорганизмов, сколько содержится в 10 литрах воздуха. 2 Фильтрационный. Используют мембранные фильтры, через которые пропускают 50-100 л воздуха со скоростью 5-10 л/мин. Затем фильтр прикладывают к стерильной среде и термостатируют 24 часа при 37˚С или фильтр отмывают в определенном количестве стерильного физиологического раствора и высевают в плотные питательные среды. Подсчитывают выросшие колонии. 3 Аспирационный. Используют аппарат Кротова, через который пропускают определенное количество воздуха. Микроорганизмы оседают на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри, установленной в аппарате Кротова. После культивирования в термостате подсчитывают выросшие колонии и пересчитывают на количество пропущенного воздуха. Воздух считают чистым при росте до 200 колоний в одной чашке, загрязненным при росте более 200 колоний. Отбор, хранение и транспортировка проб воды. Пробы воды берут из источников, используемых для поения животных: водопровода, артезианских скважин, колодцев, рек, прудов и других водоемов. Пробы воды отбирают в специально предназначенную посуду разового пользования или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микробов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками, стерильными. Во время отбора воды пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Из открытых водоемов, бассейнов, баков пробы отбирают с глубины 10 – 15 см, при малой глубине – на расстоянии не менее 10 – 15 см от дна. Из прорубей пробы берут на глубине 10 – 15 см от нижней поверхности льда. Из водоемов берут по две пробы - с поверхности, со дна и составляют среднюю пробу воды. Пробы отбирают с поверхности кружкой, банкой, со дна - батометром или бутылкой, к дну которой привязывают груз, а к горлу и пробке две веревки достаточной длины. При наличии течения пробы отбирают в месте наибольшей скорости, так как здесь происходит наиболее частая смена воды. Для выявления источников загрязнения и изучения санитарного состояния водоема воду необходимо брать выше и ниже каждого населенного пункта, который может являться источником загрязнения. Отбор проб из распределительных сетей проводят из крана после его предварительной стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. Никаких насадок, резиновых шлангов на кране не должно быть. Если из крана происходит постоянный излив воды, то отбор проб производят без предварительного обжига. При отборе воды после обеззараживания химическими реагентами, для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость для отбора проб, до стерилизации вносят натрий серновато-кислый из расчета10 мг на 500 мл воды. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований. Пробы воды из колодцев берут ведром, предварительно перемешивая воду путем многократного его погружения. Из каждого контролируемого источника воды отбирают по одной пробе, объемом не менее 1000 мл. Отобранные пробы маркируют, оформляют акт отбора проб воды с указанием времени и места взятия, и другой информации. Отобранные пробы сразу отправляют в лабораторию в контейнерах-холодильниках. При соблюдении таких условий пробы пригодны к исследованию в течение 6 часов с момента взятия. Если для охлаждения проб нет условий, то анализ их проводят не позднее 2 часов после отбора. Подготовка к исследованию Непосредственно перед посевом пробу воды необходимо тщательно перемешать и обработать край емкости над пламенем горелки. Мембранные фильтры готовят согласно указаниям завода изготовителя. Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на селективную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. Техника выполнения. При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения проводят качественный анализ – засевают 3 объема воды по 100 мл. С целью количественного определения общих колиформных бактерий и при повторном анализе проводят посев: - 3 объемов по 100 мл в 10 мл концентрированной лактозо-пептонной среды; - 3 объемов по 10 мл в 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды; - 3 объемов по 1 мл в 10 мл среды обычной концентрации. Посевы инкубируют при температуре 37°C в течение 24 – 48 часов. Через 24 часа проводят предварительную оценку. При наличии роста и образования газа производят высев петлей на секторы среды Эндо, приготовленной с добавлением фуксина. Пробирки без роста и газа оставляют при 37˚С до 48 часов. Через 48 часов посевы при отсутствии роста признают отрицательными и далее не исследуют. Из посевов, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают посев секторами на среду Эндо. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 18—20 часов. В качестве среды накопления можно использовать глюкозо-пептонную среду вместо лактозо-пептонной. Учет результатов. Положительный ответ – при образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо типичных для лактозоположительных бактерий колоний темно-красного или красного цвета с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром. Отрицательный ответ – не обнаружены в 100 мл. Метод мембранной фильтрации. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры и выращивании посевов на селективной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Определение колифагов Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса (бляшки) через 18±2 часа при температуре (37±1)°С на газоне питательного агара. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов. Наличие колифагов в воде определяют прямым и титрационным методами. Прямой метод выделения колифагов из воды применяют: - по эпидемиологическим показаниям - при необходимости получения быстрого результата анализа. Принцип метода заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри с питательным агаром. Для контроля используют чашку с чистым газоном Е. coli на питательном агаре. Единица измерения – 1 БОЕ (бляшкообразующая единица) в 100 мл воды (нижний предел). Техника проведения. Накануне проведения анализа проводят посев Е. coli на скошенный МПА. Выросшую культуру смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности готовят взвесь Е. сoli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл. Исследуемую воду 100 мл вносят в 5 стерильных чашек Петри по 20 мл в каждую. В расплавленный и охлажденный до 450С 2% МПА добавляют смыв Е. coli из расчета 1,5 мл смыва бактерий на 150 мл агара и осторожно перемешивают. Полученной смесью по 30 мл заливают сначала пустую чашку Петри (контроль), а затем все чашки, содержащие исследуемую воду. Содержимое чашек осторожно перемешивают и оставляют до полного застывания агара при комнатной температуре (на 30 минут), затем вверх дном помещают в термостат для инкубирования при температуре 370С. Учет результатов. Проводят подсчет и суммирование бляшек, выросших на 5-ти чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки колифагов должны отсутствовать. При наличии бляшек в контрольной чашке необходимо получить новый штамм Е. coli из бактериологической лаборатории областного центра госсанэпиднадзора и анализ повторить. План 1. Отбор, хранение, транспортировка проб кормов в лабораторию для микробиологического исследования. 2. Микробиологические показатели санитарной оценки кормов для животных, методы их определения. Материальное обеспечение: пробы корма (сено, мясо-костная мука, комбикорм), стерильная лабораторная посуда (чашки Петри, пипетки на 1, 2, 5, 10 мл), инструменты для отбора проб, нормативная документация, пробирки со стерильным физ. раствором по 9 мл, стерильные питательные среды (МПА в чашке Петри, МПА столбик, агар Сабуро, агар Эндо, среда Китта-Тароцци), микроскоп, спиртовки, предметные стекла, анилиновые красители. Теоретический материал Для бактериологического исследования от каждой партии корма составляют два средних образца весом не менее 500 г. Один из них направляют в лабораторию, а другой сохраняют на предприятии (хозяйстве) до окончания исследования. На пробы корма составляют сопроводительный документ в двух экземплярах. В лаборатории проводят следующие исследования: 1Определение общего количества микробных клеток. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1 : 10). Из полученной взвеси готовят последующие разведения (1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000, 1 : 100 000, 1 : 1 000 000). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы. Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10—15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44—45° С мясо-пептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37° С. После 24—48-часового термостатирования проводят подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корм 2 Исследование на патогенные сальмонеллы. Навеску исследуемого материала 50—200 г (50 г от 10 и менее, 100 г от 10 до 100 и 200 г от 101 и выше упаковочных единиц) измельчают в стерильной фарфоровой ступке и вносят в колбу, содержащую среду предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5% маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37° С. Через 16—18 часов производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами: висмут-сульфит агар, средой Плоскирева или Левина (по две чашки) и на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5. Лучшими являются селенитовый бульон и магниевая среда. После 16—18-часового выдерживания в термостате при 37° С из обогатительных сред бактериологической петлей производят вторично посевы на чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами, которые помещают в термостат при 37° С. Засеянные чашки просматривают через 16, 24, 48 часов. На висмут-сульфит агаре S. typhi и S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. cholerae suis — в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией черный. На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний, на среде Левина — в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний. 3 Исследование на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 30 минут и из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1:100, 1: 000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки (по выбору) со средами Эйкмана, Кесслера или Кода. Посевы помещают в термостат при температуре 43° С для первых двух сред и при 37° С — для последней. Через 24 часа учитывают рост: на среде Эйкмана —по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслера и Кода — по изменению цвета сред. Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в котором еще наблюдался ее рост. Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина в бактериологических чашках, разделенных на секторы для каждого разведения. 4 Исследования на анаэробы. 50 г корма растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китта — Тароцци, молоком и по две чашки со средами Вильсона — Блера и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм по одной пробирке с жидкими средами прогревают при температуре 80° С в течение 20 минут. Посевы помещают в термостат при температуре 37° С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода. Результаты посевов регистрируют в первый же день. Почернение среды Вильсона — Блера в течение 1—3 часов после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 часов, а также быстрое начало роста на среде Китта — Тароцци (через 4—5 часов) при обильном газообразовании является характерным для клостридиум перфрингенс. Рост клостридиум ботулинум, наблюдаемый обычно на 2—3-й день, характеризуется помутнением среды Китта — Тароцци, образованием осадка и запахом прогорклого масла. Биологическую пробу проводят на морских свинках или белых мышах путем внутрибрюшинного заражения бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 12—48 часов. Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида ставят опыт нейтрализации токсина специфической сывороткой. Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2—0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдерживают в термостате 45 минут и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат вводят мышам без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей, получившихсоответствующую сыворотку. 5 Исследование на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа: а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором (1 : 4) и настаивают в течение 1—2 часов при комнатной температуре. Настои центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому — смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе. б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 минут. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5—1,0 мл некипяченого фильтрата, другому — в этой же дозе прокипяченного. Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от фильтрата, не подвергнутого кипячению. Оценка кормов. Корм используют сельскохозяйственным животным при отрицательных результатах исследования на сальмонеллы, энтеропатогенные типы кишечной палочки и токсинообразующие анаэробы при условии его соответствия другим показателям действующих стандартов. При обнаружении сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной палочки, анаэробных микроорганизмов и их токсинов, протея корм запрещается использовать животным без дополнительной обработки. Микологическое и микотоксикологическое исследование кормов. Кроме бактериологических показателей в кормах определяют наличие плесневых грибов и дрожжей, а так же их токсинов. Посевы проводят на специальные питательные среды агар Чапека, Сабуро, сусло агар и другие. Микроскопическим методом определяют род гриба. Наиболее часто корма поражаются патогенными и токсигенными грибами, относящимися к родам Mucor, Rhisopus, Aspergilus, Fusarium, Penicillium, Stachybotrys. Токсины определяют постановкой биопробы на лабораторных животных. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Провести посев проб кормов с целью определения бактериологических показателей их качества. Этапы выполнения задания: 1 Подготовить пробу корма (сено, мясо-костная мука, комбикорм) к посеву в питательные среды. 2 Провести посев подготовленной пробы продукта в МПА, среду Кесслер, дифференциально-диагностическую среду Эндо, Китта-Тароцци и поставить посевы в термостат для культивирования. 3 Отчитаться преподавателю о выполненной работе. Практическое задание 2: Провести посев проб кормов с целью микологического и микотоксикологического исследования. Этапы выполнения задания: 1 Подготовить пробу корма (сено, мясо-костная мука, комбикорм) к исследованию. 2 Провести посев подготовленной пробы корма в агар Сабуро и поставить посевы в термостат для культивирования. 3 Приготовить экстракт корма для изучения токсичности. 4 Отчитаться преподавателю о выполненной работе. Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните порядок отбора, подготовки проб кормов (сухих, влажных, комбинированных) для санитарно-микробиологического исследования. 2 Какие показатели определяют при бактериологическом исследовании кормов? 3 С какой целью и как определяют микробную обсемененность корма (КМАФАнМ)? 4 Как исследуют корма на наличие энтеропатогенных штаммов кишечной палочки? 5 На чем основаны методы обнаружения сальмонелл в кормах? 6 В чем состоит микологическая и микотоксикологическая оценка кормов? 7 Как определить токсичность корма? 8 Возбудители каких инфекционных болезней могут передаваться с кормом? 9 Как определить наличие в корме возбудителя ботулизма и его токсинов? План 1. Отбор, хранение, транспортировка проб молока коровьего питьевого в лабораторию для микробиологического исследования. 2. Микробиологические показатели санитарной оценки молока коровьего питьевого, методы их определения. Материальное обеспечение: пробы молока, стерильная лабораторная посуда (чашки Петри, пипетки), стерильные питательные среды (МПА, агар Эндо, агар Сабуро, солевой агар), набор инструментов для посева, спиртовки, спички. Теоретический материал Основными источниками попадания микробов в молоко являются вымя и кожный покров животного, руки доярки, посуда, воздух и др. В процессе хранения молока микроорганизмы изменяют его свойства. Для более длительного сохранения первоначальных свойств молока необходимо снижать до минимума возможности попадания в него микроорганизмов в процессе хранения и транспортирования. При исследовании необходимо обращать внимание на количественный и видовой состав микрофлоры молока. Это дает возможность правильно вести борьбу с возбудителями порчи молока. В молоко при нарушении санитарных требований могут попасть бактерии кишечной группы, маслянокислые, гнилостные (аэробы и анаэробы), дрожжи, микроскопические грибы, которые вызывают различные пороки молока и молочных продуктов. Отбор проб. Для бактериологического исследования молока и сливок после тщательного перемешивания отбирают около 50 см3 продукта стерильным пробоотборником или черпаком в стерильную колбу, которую затем закрывают пробкой. Взятые пробы необходимо сразу же исследовать. Если взятые пробы предназначены для отправки в лабораторию, то их необходимо охладить до 5...6°С. При такой температуре можно перевозить или хранить пробы, но не более 4 ч с момента отбора. Перед отправкой образцы пломбируют или опечатывают, оформляют сопроводительный документ, в котором указывают дату, час отбора пробы, температуру продукта, должность и подпись бравшего пробу. Исследование молока проводят в соответствии с ГОСТ или СанПиН следующими методами: 1 Определение общего количества микро организмов (ОМЧ - общее микробное число, КМАФАнМ – количество мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов). Единицей измерения данного показателя является КОЕ/см³ (колониеобразующих единиц в 1 см³ ). Сущность метода: мезофильные аэробные и факультативные анаэробные микроорганизмы способны образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37ºС в течение 48 часов. При определении общего количества микроорганизмов в молоке рекомендуются следующие нормы разведения: молоко сырое 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:100000; молоко пастеризованное 1:10; 1:100; 1:1000. По 1 см3 соответствующих разведений высевают в чашки Петри и заливают расплавленной питательной средой, охлажденной до температуры 45°С (МПА) в количестве 12...15 см3. Сразу после заливки содержимое тщательно перемешивают, покачивая чашки для равномерного распределения посевного материала. Выращивание ведут в течение 2 суток при температуре 37 °С. Для определения общего количества бактерий следует выбирать те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном (без крышки) на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 8...10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками. Для подсчета общего количества бактерий в 1 см3 или 1 г образца число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение. Полученные результаты по отдельным чашкам складывают, делят на количество подсчитанных чашек и выводят среднее арифметическое, которое принимают за окончательное. Полученные числа округляют. 2 Определение общего количества бак терий в молоке косвенным методом. Для определения бактериальной чистоты и свежести молока проводят пробу на редуктазу. Метод основан на способности бактерий выделять редуктазу, восстанавливающую краски (метиленовый синий, резазурин). Обесцвечивание метиленового синего и резазурина наступает тем быстрее, чем больше микробов в молоке. Проба с метиленовым синим (редуктазная проба): в пробирки наливают 10 см3 молока и 0,5 см3 метиленового голубого. После тщательного смешивания пробирки помещают в редуктазник или водяную баню с температурой воды 38°С. Такую температуру поддерживают в течение всего опыта до полного обесцвечивания молока. Учет результатов проводят визуально через 40 минут, 2,5 часа и 3,5 часа, отмечая обесцвечивание молока. По скорости обесцвечивания метиленового синего молоко разделяют на 4 класса. 3 Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки сбраживать в питательной среде (среда Кесслер) лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37ºС в течение 24 часов. Для посева используют десятикратные разведения молока (три последних разведения). По 1 мл каждого разведения мерной пипеткой вносят в пробирки с 5 мл среды Кесслер. Посевы культивируют при температуре 37ºС в течение 24 часов. Оценка результатов: Наличие газообразования в пробирке свидетельствует о наличии БГКП в молоке. С целью идентификации БГКП проводят посев на агар Эндо. Кишечная палочка образует колонии темно-малинового цвета с металлическим блеском. 4 Определение стафилококков в молоке. 0,1 мл цельного молока растирают по поверхности солевого агара в чашке Петри. Посевы культивируют при температуре 37ºС в течение 24-48 часов. Золотистый стафилококк образует колонии лимонно-желтого цвета. Далее при необходимости проводят идентификацию микроорганизма дополнительными методами исследования. 5Определение количества дрожжей и микроскопических грибов. Делают различные разведения исследуемого материала и проводят посев в чашки Петри с агаром Сабуро. Посевной материал выдерживают в термостате в течение 3 дней при 30°С или при комнатной температуре в течение 5 суток. Подсчитывают отдельно колонии дрожжей и колонии плесневых грибов. Затем умножают на разведение и получают количество тех и других в 1 см3. При подсчете колоний в нескольких чашках определяют среднее их количество. Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания. Практическое задание 1: Провести учёт результатов исследований предыдущего занятия. Этапы выполнения задания: 1 Изучить рост микроорганизмов в питательных средах. 2 Определить в соответствии с методикой микробиологические показатели безопасности. 3 При наличии роста в питательных средах дифференцировать микроскопическим методом (окраска по Граму) культуры микроорганизмов. Практическое задание 2: Провести санитарно-микробиологическое исследование молока питьевого коровьего. Этапы выполнения: 1 Провести постановку редуктазной пробы с молоком различной бактериальной загрязненности и оценить качество различных проб молока. 2 Провести бактериологическое исследование сырого и пастеризованного молока, анализировать результаты и отчитаться преподавателю. Вопросы и задания для контроля знаний. 1Поясните порядок отбора молока коровьего питьевого для микробиологического исследования. 2 Какие нормативные документы регламентируют качество молока? 3 По каким микробиологическим показателям безопасности проводят санитарную оценку молока? 4 В чем отличие редуктазной пробы от метода посева при определении микробной обсемененности молока? 5 В каком случае молоко признают не соответствующим требуемым нормам? 6 Каким методом определяют наличие сальмонелл в молоке? 7 Поясните методику дифференциации сальмонелл и эшерихий. 8 В чем сущность определения в молоке патогенных стафилококков? 9 В чем сущность определения в молоке микроскопических грибов и дрожжей? Рекомендуемая литература и источники 1. Госманов, Р. Г. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии [Электронный ресурс] : учеб. пособие / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев, А. А. Барсков. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 397 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=45680 2. Госманов Р. Г. Микробиология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Галиуллин А. К., Волков А. Х. [и др.]. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2011. — 495 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=1546 3. Госманов Р. Г. Микробиология и иммунология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Ибрагимова А. И., А.К. Галиуллин. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2013. — 240 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=12976 4. Кисленко В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум + CD [Электронный ресурс] : учебное пособие. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2012. — 368 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=3815 5. Колычев, Н. М. Ветеринарная микробиология и микология [Электронный ресурс] : учебник / Н. М. Колычев, Р. Г. Госманов. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 632 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=39147.
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2019-03-22; Просмотров: 323; Нарушение авторского права страницы
, где