ТП.3 Выращевание вегетативного посевного материала в посевном аппарате

Вегетативный посевной материал выращивают в посевных аппаратах (поз.23), объемом 1 м³.

ТП. 3.1 Подготовка посевного аппарата к загрузке

С разрешения мастера открывают люк, тщательно промывают внутреннюю поверхность аппарата питьевой водой из шланга, затем набирают воду до покрытия барботёра и, пропуская воздух, проверяют его работу. При равномерном выходе воздуха из барботёра последний считают чистым. В случае если воздух проходит через барботёр неравномерно, проводят чистку отверстий. Пропускают через бартёр пар. Промывные воды сливают в промышленную канализацию.

Если предыдущая операция была нестерильна, перед сливом содержимого проводят проверку аппарата на герметичность при давлении воздуха 0, 12-0, 15 МПа. Массу нагревают до 100-110⁰С, подачей острого пара через все коммуникации и выдерживают 30 минут.

Содержимое аппарата, после предварительной убивки, вывозят в специально отведенное место.

В аппарат подлежащий мойки заливают небольшое количество воды, загружают едкий натр, до концентрации 3-5%. Доливают воду до люка, аппарат герметично закрывают, нагревают острым паром до 90-100⁰С при работающей мешалке и открытой воздушке. Делают выдержку при этой температуре в течении часа, затем содержимое аппарата охлаждают до температуры 35-45⁰С и передают в другой аппарат (допускается трехкратное использование моющего раствора). После промывают аппарат водой и приступают к его ремонту. Во время ремонта производят внутренний осмотр аппарата, проверяют крепление трубы барботёра, лопастей и муфт мешалки, заменяют прокладки вентилей входа и выхода, пробоотборника, прокладку люка, проверяют уплотнение вала мешалки.

Выявленные дефекты устраняют, закрывают люк, и аппарат проверяют на герметичность при давлении воздуха 0, 12-0, 15 МПа с помощью мыльного раствора. Проверяют герметичность фланцевых соединений, сварных швов, уплотнений сальников и вала мешалки, посевного штуцера, места уплотнений по резьбе манометра, прокладок крышки аппарата и люка. Давление в аппарате не должно падать в течении 30 минут. Если герметичность не достигнута, выявленные дефекты устраняют, и аппарат снова проверяют на герметичность.

Отремонтированный герметичный аппарат стерилизуют острым паром в течение 1-1, 5 часов при температуре 130-135⁰С и давлении 0, 19-0, 22 МПа. Подачу пара ведут через все подводящие трубопроводы: барботёр, пробоотборник и посевную линию. При достижении температуры 125⁰С, начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 2-3 оборота, стерилизуют в течении 30 минут. После стерилизации посевной штуцер закрывают. При достижении температуры 130-135⁰С и давления 0, 19-0, 22 МПа отмечают начало стерилизации и стерилизуют 1-1, 5 часа. Первые 30 минут стерилизуют при открытой воздушке, затем вентиль закрывают. По окончании стерилизации прекращают подачу пара и начинают охлаждать подачей воды в рубашку. При давлении в аппарате 0, 06-0, 08 МПа паровое давление меняют на воздушное и приступают к приготовлению питательной среды.

ТП.3.2 Приготовление и стерилизация питательной среды

Питательную среду для посевных аппаратов готовят также как и для инокуляторов.

Питательную среду для посевного аппарата готовят в смесителе (поз.14).

Смеситель для приготовления питательной среды представляет собой аппарат с плоским днищем и крышкой. Работает под атмосферным давлением, оснащен рамной мешалкой (чтобы происходило меньше вспенивания), гладкой приварной рубашкой, загрузка через люк.

В аппарат через люк при работающей мешалке загружают питьевую воду, добавляют навеску кукурузной муки, предварительно взвесив на весах WI-1 (поз.1), нагревают глухим паром до температуры 70-88⁰С. И при этой температуре разваривают муку в течение 30 минут при включенной мешалке.

Затем добавляют навески мела, соли предварительно разведённые водой и тщательно перемешанные. В смеситель также поступает кукурузный экстракт из сборника (поз.4) при помощи насоса (поз.8). Доводят рН до 6, 8-7, 2 40% раствором щелочи ( контроль по прибору QI – 21-2), который насосом (поз.15) передают из сборника (поз.11). Затем через люк загружают пеногаситель адеканоль.

При непрерывно работающей мешалке приготовленную питательную среду по трубопроводу, предварительно отработанному паром, центробежным насосом (поз.18) передают в посевной аппарат (поз.23).Перед насосом (поз.18) стоит мембранный фильтр (поз.17), состоящий из нержавеющей металлической сетки. Он служит для механического удаления комочков в питательной среде. Комочки необходимо удалять для того, чтобы стерилизация среды была эффективная, так как в центре комочка могут не погибнуть микроорганизмы и вероятен риск контаминации.

После передачи питательной среды в посевной аппарат при закрытой воздушке открывают вентиль подачи воздуха на барботёр. При достижении воздушного давления 0, 12-0, 15 МПа вентиль подачи воздуха на барботёр перекрывают.

При наборе давления, во избежание попадания среды из инокулятора в индивидуальный фильтр, строго соблюдается положение: давление на индивидуальном фильтре на 0, 02-0, 04 МПа выше, чем на аппарате.

При давлении на паровой магистрали 0, 25-0, 3 МПа, при работающей мешалке, после предварительного спуска воды и конденсата из рубашки, подают острый пар в аппарат: через посевную линии, барботёр и пробоотборник.

При температуре 105⁰С прикрывают воздушку, оставляя ее открытой на 0, 5-1 оборот, при температуре 115-117⁰С начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 1, 5-2 оборота и стерилизуют его в течении 30 минут. При достижении температуры 127-129⁰С (контроль по прибору TIRC – 17-2) и давлении 0, 15-0, 17 МПа (контроль по прибору PI-23) отмечают начало стерилизации и стерилизуют аппарат со средой в течении одного часа при постоянно работающей мешалке. По окончании стерилизации среды прекращают подачу острого пара и начинают охлаждение путём подачи захоложенной воды в рубашку аппарата.

При снижении давления пара до 0, 06-0, 08 МПа меняют паровое давление на воздушное. Охлаждение среды ведут до температуры 26-28⁰С, при этом давление в аппарате поддерживают стерильным сжатым воздухом в пределах 0, 05-0, 06 МПа.

Перед посевом после 30 минутной пропарки пробника, в зоне огня (соблюдая асептику), отбирают пробу среды для определения биохимического состава рН и стерильности. После отбора проб пробник оставляют на пропарке.

Питательная среда должна иметь следующий биохимический состав:

-углеводы 1-1, 7%

-рН 6, 8-7, 2

Результаты анализа записываются в микробиологическом журнале.

ТП.3.3 Засев питательной среды и выращивание вегетативного посевного материала

Простерилизованную и охлаждённую до 26-28⁰С среду, после отбора первой пробы на стерильность и биохимический состав, засевают посевным материалом из инокулятора (поз.21).

Посев по посевной линии, простерилизованой острым паром, занимает один час. После посева отбирается проба на определение отсутствия посторонней микрофлоры и рН среды, результаты записываются в журнал.

По окончании передачи посевного материала закрывают вентили на посевной линии, сначала у посевного аппарата, а затем у инокулятора. Посевную линию пропаривают острым паром в течение 15-20 минут. После посева устанавливают воздушное давление в аппарате 0, 03-0, 05 МПа. Температуру выращивания поддерживают 26-28⁰С (контроль по прибору TIRC – 30-2). Количество подаваемого воздуха 30-48 м³/час (контроль по прибору FI – 34-2). Мешалка работает непрерывно.

Температура подаваемого воздуха 50-55⁰С, продолжительность выращивания 36-48 часов.

При сильном вспенивании добавляют из колб стерильный пеногаситель- адеканоль. Указанные параметры ежечасно аппаратчик записывает в журнал.

Через каждые 6 часов из аппарата, в асептичных условиях, отбирают пробы для контроля развития лучистого гриба, отсутствие постороннй микрофлоры, рН (контроль по прибору QI – 32-1), результаты записывают в журнал микробиолога.

Посевной материал для передачи в ферментатор должен соответствовать:

-рН 6, 8-7, 0

-внешний вид – густая хлопьевидная масса, заполняющая не менее 1/3 объёма пробы

-при микроскопировании окрашенного препарата, мицелий должен иметь вид густого скопления звёздчатых микроколоний с хорошо развитыми ветвящимися гифами членистого строения.

К моменту передачи посевного материала, в высевах из исходного мицелия, питательной среды и всех проб из посевного аппарата должна отсутствовать посторонняя микрофлора, а также должна отсутствовать посторонняя микрофлора при микроскопировании пробы перед подачей посевного материала в ферментатор.

Если посевной материал не соответствует требованиям, то он в производстве не используется, а содержимое аппарата нагревается до 123-125⁰С, выдерживается один час и сливается в промышленную канализацию.

ТП.4 Биосинтез леворина

Биосинтез леворина осуществляется в ферментаторе (поз.27) объемом 10 м³.

ТП.4.1 Подготовка ферментатора к загрузке

С целью сокращения времени подготовки ферментатора, ремонт верхней части аппарата производится в конце предыдущей операции и во время слива культуральной жидкости: набивают сальники вентилей, меняют прокладки клапанов и вентилей, опрессовывают конденсатные вентили. Одновременно проверяют герметичность всех соединений на воздушном фильтре и всех связывающих их трубопроводов.

После слива культуральной жидкости с ферментатора снимают давление до 0 и, получив письменное разрешение мастера, открывают люк. Промывают аппарат питьевой водой, пропаривают барботёр 15-20 минут, проверяют степень его загрязнения и в случае необходимости прочищают отверстия механически. После слива промывной воды чистят смотровые стёкла.

Ферментатор продувают воздухом, охлаждают до температуры не выше 30⁰С и готовят к внутреннему осмотру. Осматривая аппарат, обращают особое внимание на состояние торцевого уплотнения вала мешалки, подпятника, промежуточной опоры вала мешалки и барботера. При проведении внутреннего осмотра рабочий обязан соблюдать требования, инструкции № 0-41-Н, по организации безопасного проведения работ в аппаратах, резервуарах, емкостях, цистернах, а также в колодцах, коллекторах и других сооружениях.

После проведения внутреннего осмотра продолжают слесарную подготовку:

-заменяют прокладки клапанов, вентилей на посевной, загрузочной и сливной линиях

- проверяют торцевое уплотнение вала мешалки

-проверяют вентили на паровых, конденсатных, воздушных линиях на герметичность.

Замеченные дефекты устраняют. Затем закрывают люк, создают в ферментаторе и во всех прилегающих коммуникациях воздухом избыточное давление 0, 12-0, 15МПа, и снова проверяют на герметичность, особенно люк ферментатора (с помощью мыльного раствора). Ферментатор считается герметичным если давление в аппарате не падает в течение 30 минут. Проверяют герметичность вентилей паром и приступают к стерилизации аппарата.

Перед нагревом аппарата сливают воду из змеевиков в канализацию и оставляют вентиль слива из змеевиков и вентиль воздушки открытым на весь период стерилизации. Закрывают смотровые стекла ватой и металлическими лючками, закрепив их штифтами. Стерилизацию аппарата проводят острым паром подавая его в верхнюю зону аппарата через линию выхода воздуха из аппарата, через материальные линии (загрузочная, посевная, линия подачи зеленой патоки), через линию подачи пара на пропарку смотровых стекол и пара на дозатор. В течении всей стерилизации вентиль на линии нижнего спуска открыт полностью, а вентиль на линии сбора конденсата с нижнего спуска на 2-3 оборота. При достижении в аппарате 100⁰С на сливной линии подают пар через барботер и линию пробника.

При температуре 135-140⁰С отмечают начало стерилизации, стерилизуют 20-30 минут при температуре 130-140⁰С в нижней зоне аппарата и давлении 0, 26-0, 27Мпа.

По окончании выдержки закрывают вентиль нижнего спуска от аппарата и ставят его на паровую завесу. Открывают вентиль подачи пара на нижнем спуске и вентиль на линии сбора конденсата на линии нижнего спуска и оставляют его открытым на пол оборота. Закрывают вентили на линии выхода воздуха из аппарата на загрузочной и посевной линиях, на линии подачи зеленой патоки, на линии подачи пара на смотровые стекла барботер и дозатор.

При падении давления в аппарате до 0, 07-0, 09 МПа открывают вентиль подачи воздуха на барботер и заменяют паровое давление воздушным.

Охлаждают аппарат, для чего закрывают вентиль слива воды из змеевиков, вентиль воздушки, открывают вентили входа и выхода воды из змеевиков.

Поддерживают давление 0, 03-0, 05 МПа стерильным сжатым воздухом и приступают к приему питательной среды. Во время охлаждения и приема питательной среды все принимающие коммуникации должны быть под паром.

После нестерильной операции и по графику (1 раз в месяц) проводят обработку внутренней поверхности ферментатора 3-5% раствором щелочи, а также проверяют герметичность змеевиков путем подачи в них воды под давлением 0, 3МПа.

ТП.4.2 Приготовление и стерилизация 40% раствора зеленой патоки

Приготовление раствора зеленой патоки производят в аппарате (поз.25), куда насосом (поз.19) передают расчетное количество зеленой патоки из сборника (поз.16)

Стерилизуют 40% раствор зеленой патоки при температуре 120-122⁰С (контроль по прибору TIRC – 35-2) и давлении пара 0, 1-0, 12 МПа (контроль по прибору PI-39) в течение 30 минут при постоянно работающей мешалке. Затем охлаждают до 28⁰С, путем непрерывного прохождения воды через рубашку, в аппарате поддерживается давление 0, 09-0, 1 МПа. В асептичных условиях (под факелом), отбирают пробу раствора зеленой патоки для определения процентного содержания зеленой патоки в растворе, РН и для высева на стерильность.

Раствор зеленой патоки должен быть:

-стерильным;

-РН 3, 9-4, 2 (контроль по прибору QI – 37-2);

-процентное содержание 40%.

Система подачи зеленой патоки готовится одновременно с ферментатором.

Подачу раствора зеленой патоки осуществляют по стерильному коллектору. Проверяют герметичность коллектора при давлении 0, 12-0, 15МПа в течении 30 минут. При герметичности коллектора зеленой патоки приступают к его стерилизации.

Стерилизуют коллектор при температуре 130-135⁰С и давлении 0, 17-0, 22 МПа в течении 30 минут при открытых спусках конденсата у аппаратов. По истечении 30 минут закрывают вентили спуска конденсата на всех линиях. Дозирование зеленой патоки полунепрерывно с помощью автоматической системы при повышении РН выше 7, 5 и снижении глюкозы в культуральной жидкости до концентрации 0, 9-1, 0%

ТП.4.3 Приготовление и стерилизация питательной среды

Питательную среду готовят в отделении приготовления питательных сред в смесителе (поз.3).

Питательная среда готовится по следующей прописи:

-кукурузная мука 3%

-соевая мука 2%

-зеленая патока 2%

- зеленая патока на доливы 5, 13%

-соль поваренная 0, 5%

-мел химически осажденный 0, 3%

-пеногаситель адеканоль 0, 1%

-едкий натр до РН 7, 0-7, 3.

Отвешивают навески всех компонентов среды в количестве указанном в прописи. В аппарат набирают 2670 литров питьевой воды и загружают навески кукурузной и соевой муки при помощи системы пневмотранспорта (контроль по прибору WI-2) (поз.2). Компоненты загрузаются при работающей мешалке. Смесь нагревают острым паром до 80-90⁰С и выдерживают при этой температуре 30 минут. Затем в смесь загружают навеску мела и соли поваренной так же при помощи системы пневмотранспорта. Систему пневмотранспорта мы можем использовать как для соевой и кукурузной мук, так и для мела. Данная система защищена от накопления частиц на поверхности пневмотранспорта.

В смеситель так же передают раствор и зеленой патоки из сборника (поз.16) насосом (поз.19).

Зеленая патока – отход производства глюкозы из крахмала. При получении глюкозы крахмал подвергают гидролизу соляной кислотой или ферментными перпаратами, обладающими амилолитической активностью. Полученный глюкозный сироп нейтрализуют содой, упаривают и проводят кристаллизацию. Кристаллы глюкозы отделяют, а образующийся при этом маточник называется зеленой патокой.

По окончании приготовления питательной среды доводят рН до 7, 0-7, 3 раствором едкого натра (контроль по прибору QI – 6-2), который поступает из сборника (поз.11) при помощи насоса (поз.15). Затем добавляют пеногаситель адеканоль.

Температуру концентрата 70-80⁰С поддерживают при помощи острого пара (контроль по прибору TIRC – 3-2). Питательную среду из смесителя (поз.3) насосом поз. 7 передают на УНС, состоящую из нагревателя (поз.9), выдерживателя (поз.13) и теплообменника типа труба в трубе (поз.20).

Перед стерилизацией проводят ревизию насосов и КИП на УНС, а всю УНС вместе с линией подаче среды в ферментатор проверяют на герметичность мыльной пеной при воздушном давлении 0, 12-0, 15 МПа при закрытых вентилях на конденсатных линиях.

Затем снимают воздушное давление и стерилизуют острым паром при температуре 130-135⁰С и паровом давлении 0, 17-0, 22 МПа в течении часа.

Концентрат питательной среды в нагревателе нагревают до температуры 124-126⁰С (контроль по прибору TIRC - 16-2) острым паром с давлением 0, 45-0, 5МПа. Из нагревателя среда поступает в выдерживатель и выдерживается в нем при температуре 126-128⁰С в течении 10-15 минут.

Из выдерживателя среда поступает в теплообменник, где охлаждается водой до 49-51⁰С ( контроль по прибору TIRC – 25-2), а затем в ферментатор. При приеме среды в ферментаторе поддерживается давление 0, 03-0, 05 МПа, одновременно среда охлаждается до температуры 26-28⁰С водой через змеевики (контроль по прибору TIRC – 40-2).

Мешалку включают после закрытия нижнего яруса мешалки. После подачи концентрата среды таким же образом из смесителя (поз.3) через УНС пропускают промывные воды в количестве 1920 литров.

Объем среды в аппарате контролируется через смотровые стекла до достижения уровня, отмеченного хомутом на валу мешалки.

Для контроля за качеством приготовленной среды из ферментатора отбирают пробу для определения стерильности, рН, содержания питательных веществ.

Среда должна иметь следующие показатели:

-общие углеводы 3, 5-4, 0%;

-глюкоза 0, 9-1, 0%;

-азот аммонийный 30-50мг% или 0, 0033-0, 017моль/л;

-рН 6, 8-7, 2.

ТП.4.4 Засев питательной среды и биосинтез

Посевной материал для засева ферментатора – вегетативный мицелий, его подают в количестве 10-15% от объема среды в ферментаторе.

Посев производят по посевным линиям простерилизованным в течении1-1, 5 часов при давлении пара 0, 18-0, 2 МПа. Посев производят следующим образом: закрывают вентили на посевной линии на отростках посевных аппаратов не участвующих в посеве; закрывают вентиль подачи пара в посевную линию у посевного аппарата и ферментатора, участвующего в посеве; снимают воздушное давление в ферментаторе до 0, 03-0, 04 МПа и включают мешалку; повышают воздушное давление в посевном аппарате до 0, 12-0, 15 МПа; открывают вентили на посевной линии посевного аппарата и ферментатора.

Во время посева посевная линия должна быть холодной.

По окончании передачи посевного материала закрывают вентили на посевной линии посевного аппарата и ферментатора, отростки ставят под пар, а посевной коллектор подвергают стерилизации.

Процесс биосинтеза леворина осуществляется путем глубинного культивирования продуцента Streptomices levoris штамм 78 на питательной среде с дозацией источника углеводов по ходу процесса ферментации.

Характерная особенность биосинтеза леворина заключается в том, что антибиотик находиться в основном в мицелии и практически не выделяется в жидкую фазу культуральной жидкости. Эта особенность определяет процесс биосинтеза, поскольку существует прямая зависимость между накоплением мицелиальной массы микроорганизма и количеством образуемого антибиотика.

Источник углеводов- зеленая патока- подается с такой скоростью, чтобы поддерживать уровень глюкозы 1, 5-1, 7% в среде, уровень аммонийного азота 30-50мг%, pН 7, 2-7, 5 (контроль по прибору QI – 42-2) в период интенсивного синтеза леворина.

В процессе биосинтеза леворина поддерживается постоянное соотношение 0, 3-0, 5 количество подаваемого раствора зеленой патоки (по глюкозе) к остаточной концентрации глюкозы в среде.

Введение 40% раствора зеленой патоки начинается с 30-36 часов ферментации при снижении концентрации глюкозы в среде до 1, 0-1, 3%, для поддержания в среде концентрации глюкозы 1, 5-1, 7%. При снижении концентрации глюкозы в среде ниже 1, 5% повторно вводят раствор зеленой патоки. Дозирование зеленой патоки полунепрерывно с помощью автоматической системы. На блоке дозирования соответствующего аппарата установлен переключатель на определенное число импульсов соответствующих необходимой дозе. Перед включением дозации устанавливают постоянный перепад давлений между аппаратом для приготовления зеленой патоки и ферментатором и поддерживают его постоянно.

Включают тумблер «Сеть» и нажимают кнопку включения. Начало дозирования показывается загоранием светового сигнала, он работает всю подачу дозы, потом автомат отключается и тумблер «Сеть» отключается.

Для предотвращения защелачивания среды выше рН 7, 3 осуществляется:

-проверка качества сырья;

-проверка качества посевного материала;

-не допускаются нарушения норм времени и температур стерилизации питательной среды;

-производится подсев к культуральной жидкости свежего посевного материала;

-скорость дозирования зеленой патоки регулируется в зависимости от концентрации аммонийного азота и рН среды.

Оптимальные условия:

- температура 28-29⁰С (контроль по прибору TIRC – 40-2);

-давление 0, 03-0, 05 МПа (регулируется вентилем на линии входа воздуха);

-температура воздуха 50-55⁰С;

-непрерывное перемешивание;

-подача воздуха;

-первые 5-6 часов 0, 5 объема к объему среды в минуту;

- затем 1, 5 объема к объему среды в минуту.

Подача зеленой патоки прекращается не позднее 12 часов до слива культуральной жидкости.

Общий расход зеленой патоки составляет 5-5, 5% от объема среды.

Для гашения пены применяется адеканоль.

Три раза в сутки отбирают пробы в асептичных условиях, где проверяют:

-стадии развития гриба (микроскопированием);

-отсутствие посторонней микрофлоры;

-pН;

-содержание глюкозы;

-содержание аммонийного азотa;

-активность леворина в культуральной жидкости.

Время ферментации 104-115 часов в зависимости от антибиотикообразования. Активность культуральной жидкости леворина 51000-67000Ед/мл (если активность менее 30000Ед/мл, то культуральную жидкость убивают и сливают в промышленную канализацию. Культуральная жидкость должна соответствовать:

-прекращено накопление антибиотика;

-отсутствие посторонней микрофлоры;

-содержание углеводов не более 1%;

-рН 6, 8-7, 2.

-активность больше 30000Ед/мл

-внешний вид: неоднородная жидкость желтого цвета с коричневым оттенком

-морфология: протоплазма гиф слабобазофильна, появляются зерна метахроматина.

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 9 10 Следующая ⇒