Методы исследования белкового обмена.

Определения общего белка в сыворотке \плазме\ крови и других биологических жидкостях.

Все известные способы определения концентрации общего белка в сыворотке крови подразделяют на следующие основные группы:

1.Азотометрические, основанные на установлении количества белкового азота - метод Кьельдаля и его модификации.

2.Способы, состоящие в определении плотности сыворотки - неточные, т.к. плотность зависит не только от содержания белков.

3.Весовые - белки сыворотки крови осаждают, высушивают до постоянного веса и взвешивают на аналитических весах. Методы трудоемки и требуют большого количества сыворотки.

4.Рефрактометрические - не совершенны, т.к. часть рефракции обуславливается иными компонентами сыворотки.

5.Колориметрические - наиболее распространенным является биуретовый метод, являющийся унифицированным.

6.Другие методы - нефелометрические, поляриметрические, спектрофотометрические не получили широкого распространения.

Отечественной промышленностью налажен выпуск наборов для исследования концентрации общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции. На этом же принципе основано измерение уровня общего белка в биологических жидкостях с помощью реактивов, поставляемых различными фирмами.

Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции.

Реактивы.

1.0, 9% раствор хлористого натрия /0, 9 г хлористого натрия на 100 мл дистиллированной воды/.

2.0, 2Н раствор едкого натрия, свободного от углекислого газа /20 мл 1Н едкого натрия доводят до 100 мл прокипяченной дистиллированной водой/.

3.Биуретовый реактив: 4, 5г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0, 2Н раствора едкого натрия, затем прибавляют 1, 5 г сернокислой меди и 0, 5 г едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла, раствор стоек.

4.0, 5% раствор йодистого калия в 0, 2Н растворе едкого натрия.

5.Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл раствора йодистого калия. Раствор стоек.

6.Стандартный раствор альбумина из человеческой или бычьей сыворотки: 10% раствор альбумина в 0, 9% растворе хлористого натрия /1 мл раствора содержит 0, 1 г белка - 100г/л/.

Принцип метода.

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет \биуретовая реакция/.

Ход определения: к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива прибавляют 0, 1 мл сыворотки, смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин \ и не позднее часа\ измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540-560 нм \зеленый светофильтр\ против контроля.

Контроль: к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива прибавляют 0, 1 мл 0, 9% раствора хлористого натрия, далее обрабатывают как опыт.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Нормальные величины общего белка - 65-85 г\л.

Построение калибровочного графика.

Реактив: стандартный раствор альбумина 10% в 0, 9% растворе хлористого натрия, 1 мл которого содержит 0, 1 г белка. Для приготовления реактива можно использовать лиофилизированный альбумин из набора «Билирубин-эталон» фирмы Лахема. В инструкции набора указывается содержание альбумина в мг. Исходя из этого, делаем расчет, сколько необходимо к данному альбумину прилить 0, 9% хлористого натрия, чтобы получить в 1 мл раствора 0, 1 г белка.

Например: в инструкции набора указано, что лиофилизированный альбумин содержит 160 мг альбумина. Расчет: стандартный 10% раствор содержит 10г или 10 000 мг в 100 мл

в эталоне 160 мг в Х

Х = 1, 6 мл, т.е. добавляем в бутылочку, где содержится альбумин 1, 6 мл 0, 9% хлористого натрия и получаем, что 1 мл этого раствора содержит 0, 1 г белка.

После приготовления стандартного раствора готовим из него серию рабочих разведений по таблице:

№пробирки

стандартный раствор белка в мл

0.9% раствор хлористого натрия

концентрация белка в г\л

1 0.4 0.6 40

2 0.6 0.4 60

3 0.8 0.2 80

4 1.0 - 100

Вычисление концентрации белка в г\л.

1 мл стандартного 10% р-ра содержит 0, 1 г белка

0.4 мл - Х

Х=0, 04.

0, 04 г белка содержится в 1 мл раствора

Х в 1 000 мл

Х= 40 г\л.

Из каждого рабочего разведения соответствующей концентрации берут по 0.1 мл в 3-4 пробирки, т.е. каждое определение проводят в 3-4 параллелях и в каждую пробирку прибавляют по 5 мл биуретового реактива. Через 30-60 мин колориметрируют на ФЭКе против контроля. Получаем на каждую концентрацию 3-4 показания оптической плотности. Находим из них среднее арифметическое, предварительно отбросив резко отклоняющиеся показания.

Строим калибровочный график: по оси абсцисс откладываем концентрацию белка в г\л, т.е. 40-60-80-100г\л; а по оси ординат показания оптических плотностей, полученных на ФЭКе \среднее арифметическое/.

Калибровочная кривая должна иметь вид примой, проведенной через 3 точки. Данную кривую проверяют на сыворотках доноров \не менее 3-4 определений\. При получении нормальных показаний белка, т.е. в пределах нормы; построенную калибровочную кривую используют в работе.

Примечание.

1.Калибровочную кривую необходимо строить не менее 1 раза в год, а также каждый раз после ремонта и на вновь полученном фотоэлектроколориметре.

2.Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией сохраняется до Д=0, 5. Если в сыворотке содержится большее количество белка, то сыворотку разводят хлористым натрием вдвое.

Определение мочевины в крови и моче.

Мочевина является основным азотсодержащим продуктом катаболизма белков.

При распаде белков накапливается аммиак – токсичное вещество. Основным путем обезвреживания аммиака является синтез мочевины в печени. Концентрация мочевины в крови зависит от скорости ее образования в печени и удаления из организма через почки с мочой.

У большинства пациентов скорость образования мочевины отражает скорость утилизации и распада клеточного белка.

При тяжелой патологии печени способность гепатоцитов синтезировать мочевину нарушается, аммиак накапливается, а содержание мочевины в крови снижается.

Выведение образовавшейся мочевины происходит с мочой и зависит от выделительной функции почек.

Определение мочевины проводится следующими методами:

1. Химический метод по цветной реакции с диацетилмонооксимом.

2. Ферментативный метод (уреазный)

3. Метод «сухой химии».

Определение мочевины по реакции с диацетилмонооксимом.

Реактивы.

1.Диацетилмонооксим и тиосемикарбазид или реагент в таблетках.

2.Эталонный или стандартный раствор, содержащий в 100 мл 100 мг мочевины или в 1 мл - 1 мг.

Приготовление растворов.

Раствор реагента: 1 таблетку растворить при нагревании в мерной колбе на 50 мл в 30 мл дистиллированной воды. После охлаждения довести объем до отметки. Раствор устойчив несколько недель.

Раствор серной кислоты: в мерную колбу на 250 мл вносят 150 мл дистиллированной воды и 25 мл 96% серной кислоты ЧДА. Нагревают после охлаждения доводят объем до метки. Раствор устойчив.

Рабочий раствор реагента и серной кислоты готовится перед реакцией в соотношении 1: 1 (см. схему определения).

Принцип метода.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом при наличии тиосемикарбазида и солей железа в сильно кислой среде комплекс красного цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины.

Ход определения.

Реактивы Опыт Контроль Стандарт

1.сыворотка 0, 02 - -

2.рабочий раствор

а\раствор реагента 2, 0 2, 0 2, 0

б\раствор серной

кислоты 2, 0 2, 0 2, 0

3.стандартный р-р

мочевины - - 0, 02

Выдержать 10 минут в кипящей водяной бане. Охладить 2-3 минуты в струе холодной воды. Колориметрировать не позднее, чем через 15 минут: светофильтр зеленый \при длине волны 490-540\, кювета на 1 см, против контроля.

Расчет: До

Х= -------- * С ст в ммоль\л, где

Д ст

До - оптическая плотность опыта;

Дст - оптическая плотность стандартного раствора мочевины или эталона;

С ст - концентрация мочевины в стандартном растворе;

Х - концентрация мочевины в пробе сыворотки.

Для пересчета мг % в ммоль\л используется коэффициент – 0, 1665.

Нормальные величины мочевины в сыворотке крови - 2, 5 -8, 3 ммоль\л.

Примечания.

1. Выше приведенный ход определения можно модифицировать, увеличив объемы всех отмериваемых растворов в 2-3 раза, в зависимости от объема кювет.

2. При содержании мочевины выше 23, 2 ммоль\л сыворотку необходимо разбавить физиологическим раствором и конечный результат умножить на коэффициент разбавления.

3. Перерасчет показателей мочевины в азот мочевины можно сделать умножением на фактор 0, 466.

4. Тиосемикарбазид является ядовитым реактивом. При работе с ним необходимо соблюдать правила работы с ядовитыми веществами.

⇐ Предыдущая 1 2 3 4 5 67